核桃(Juglans regia L.)是重要的坚果和木本油料树种，原产于我国，是古老的栽培植物之一，研究和评价核桃资源的遗传多样性，对进一步探讨核桃的起源和进化，开展种质资源的考察搜集，指导制定核桃资源遗传多样性保存措施、确定核桃资源遗传多样性保护范围和保护地点，合理开发利用核桃种质资源，以及指导核桃优异种质的创新和新品种选育均具有重要意义(李国和, 2007)。新疆作为世界核桃的原产地之一，蕴藏着无数优良特异性状和遗传多样性，是天然的基因库，在北疆存在着天然的野生核桃林，南疆存在早实、薄皮核桃，而且在各地州分布着许多树龄较大的古老核桃树种，这将为新疆核桃资源的研究与应用提供良好的基础。林培钧和崔乃然(2000)对分布在伊犁野果林中的新疆野核桃生境、形态特征、生物学特性以及种下类型进行了详细的调查研究，认为新疆野核桃可能是栽培核桃的直接祖先，但有待于从分子水平上进一步研究确认(刘晓丽和陈学森, 2008)。吴燕民等(2000)应用RAPD对新疆、华北和秦巴山地，西藏高地核桃进行聚类分析发现新疆核桃属于单独的一个地理生态型。金强等(2009)采用AFLP对温宿核桃林场、库车县、库尔勒若羌县、喀什叶城县，和田地区、伊犁巩留野生核桃林的核桃种质资源进行分析发现新疆核桃各居群种质之间存在差异，具有一定的地域特征，同一产地的核桃种质资源基本聚在同一个类群中，各居群之间核桃种质资源存在着一定程度上的交流现象。目前，对新疆核桃群体内的遗传多样性研究还比较少，对群体内的遗传和变异现象进行研究将有助于进行筛选，组合，选育优良品种。本实验的目的在于利用RAPD分子标记技术研究新疆六个核桃品种实生群体的遗传多样性，揭示新疆核桃品种的多样性，并进行分类，分析相互遗传关系，为进一步从分子水平上研究新疆核桃遗传多样性提供研究基础。

1结果与分析
1.1RAPD扩增
通过对55个随机引物进行再次筛选，筛选出了7个重复性较好的引物。部分扩增结果(图1和图2) 。

图1 S26, S95, S121和 S126在六个品种上的扩增结果 注: M: Marker (100 bp~2 000 bp); S26: 1~6; S95: 7~12; S121: 13~18; S126: 19~24 Figure 1 The result of amplified in six walnut-species by S26, S95, S121 and S126 Note: M: Marker (GM335); S26: 1~6; S95: 7~12; S121: 13~18; S126: 19~24

图2 S21, S135, S151和S245在六个品种上的扩增结果 注: M: Marker(GM335); S21: 1~6; S135: 7~12; S151: 13~18; S245: 19~24 Figure 2 The result of amplified in six walnut-species by S21, S135, S151 and S245 Note: M: Marker(GM335); S21: 1~6; S135: 7~12; S151: 13~18; S245: 19~24

经过筛选获得的7个引物在母本上共扩增出了81条扩增带，其中多态性条带为63条，占77.8%，平均每条引物扩增出9条。在六个核桃品种F1代单株群体上扩增的多态性片段数和比率如表1，扩增片段的大小为200 bp~2 500 bp。

表1六个核桃品种F1代多态性位点比率 Table 1 The diversity loci rate of six walnut-groups

1.2遗传多样性分析
1.2.1品种间母本遗传多样性分析                                           
以筛选出的7个随机引物在新疆六个核桃品种母本和F₁代单株上检测出的条带为遗传信息基础，用SPSS16.0软件进行聚类分析，采用欧式平方计算遗传距离(如图2)，根据遗传距离，采用非加权类平均法作遗传聚类分析图(如图3)。

从聚类分析图中可以看出，可将六个核桃品种母本主要分为三类：其中轮5和轮6聚成了一类；首先轮2、轮3、轮4聚成一类，轮2和轮4的遗传距离较近；而轮1则单独聚成了一类，与其他母本的遗传距离较远。根据本实验室前期的研究结果，其中轮1、轮2、轮3、轮4、轮5为早实核桃互交，轮6为晚实核桃为母本，早实核桃为父本杂交推测，轮5和轮6可能来自于亲缘关系较近的早实核桃父本，也可能拥有同一早实核桃父本，轮2、轮3、轮4可能来自于亲缘关系较近的早实父本或母本，而轮1的早实父本可能距其它品种的父母本亲缘关系稍远。然而，要更加清楚地说明这六个新疆核桃品种之间的亲缘关系和遗传多样性，需要进一步的研究。

图3 六个核桃品种母本的UPGMA聚类分析图 注: 1:母本1; 2: 母本2; 3: 母本3; 4: 母本4; 5: 母本5; 6: 母本6 Figure 3 The UPGMA dendrogram of the six walnut-species based on genetic distances Note: 1: Lun 1; 2: Lun 2; 3: Lun 3; 4: Lun 4; 5: Lun 5; 6: Lun 6

1.2.2 F1实生后代遗传多样性分析
对筛选出来的引物在六个核桃品种F1代单株上的扩增结果进行统计和分析，结果表明：6个品种F₁代可以明显地划分为距离较远的两类：第一类为轮6的四个F₁代单株；第二类为其余的所有样品。第二类又可以分为三亚类，第一亚类为轮3的F1代单株3-8，第二亚类为轮5的17个F₁代单株和轮2的1个F₁代单株；第三亚类为其余的样品。计算各群体母本和个体之间的遗传距离，可以看出，各群体母本之间的遗传距离为0-1(表2)，平均遗传距离为0.5215；轮1 F₁代群体遗传距离为0.000-0.124；轮2 F₁代群体的遗传距离为0.000-0.209；轮3 F₁代群体遗传距离为0.000-0.333；轮4 F₁代群体遗传距离为0.000-0.338；轮5 F₁代群体遗传距离为0.000-0.547；轮6 F₁代群体遗传距离为0.000-0.428，可以看出，轮1 F₁代之间的遗传距离相对较小，个体之间的差异较小；而轮5 F₁代群体之间的遗传距离相对较大，个体之间的差异相对较大，说明具有较好的遗传与变异资源。从六个品种的母本和F₁代单株聚类分析结果中可以看出，轮1F₁代单株与母本聚在一起，而轮5和轮6；轮2，轮3和轮4 F₁代单株之间存在着相互的交叉聚类，这与其母本的聚类结果相似。原因可能是如前期试验得到的实验结果所说的轮5和轮6可能来自于亲缘关系较近的早实核桃父本，也可能拥有同一早实核桃父本。轮2、轮3、轮4则可能来自于亲缘关系较近的早实父本或母本，这有待于进一步研究，而且，通过对引物在母本和F₁代上扩增条带的统计可以看出，在母本上出现的条带在子代上并不是都出现，子代上有新的条带出现，这说明核桃基因组是相对较保守的，但也存在着一定程度上的差异，这可能是由于自然授粉产生了新的变异，这将有利于得到较丰富的种质资源，对核桃育种将是珍贵的资源。

表2六个品种母本间遗传距离(下三角) Table 2 The distance of female parents of six walnut-groups

2讨论 
对于核桃种质资源的分类国际上并没有比较系统的方法和标准。目前认为核桃种群演化发展的主要动力是种内个体间及种间的天然杂交和各种生境下的自然与人为选择(吴燕民等, 2000)。一些学者把我国的核桃栽培种分为新疆核桃、华北山地核桃、秦巴核桃和西藏高地核桃。由此可以看出，新疆核桃是其中较重要的资源之一。近年来，核桃产业在新疆得到了较好的发展，成为创收的一部分产业，但良种和无性系生产的不断扩大使资源遭受了破坏，使得一些适应性较强的地方品种和野生种逐渐被淘汰，呈现出单一化。为了改善这种单一化的局面，对新疆核桃资源进行较全面的研究是比较重要的，将有助于种质资源的保存于应用，对其进行种质资源遗传多样性的研究将是核桃新品种选育的理论基础。

遗传多样性是决定物种发生、进化、选择、重组和创新的物质基础(解新明和云锦凤, 2000)(夏铭, 1999)。从分子遗传角度来看，表型的差异归根到底是基因型和基因组的差异，对这些基因组序列差异的比较研究为植物系统与进化研究提供了最直接的依据(王红霞, 2006)。目前，在遗传多样性研究的几种标记方法中，分子标记已经成为一种简便、可靠的鉴定方法，广泛用于核桃遗传多样性的研究。王宝庆采用SSR分子标记技术对四川西部的川毫和知母群体进行遗传多样性的比较分析发现川毫铁核桃群体的遗传丰富度高于知母核桃群体，与表型多样性观察结果一致(王宝庆, 2007)。郭传友等(2008)采用RAPD分子标记技术对山核桃天然群体进行遗传结构分析发现大部分的变异存在居群内，居群间基因交流相对较少，并且地理隔离、居群内近交及居群间有限的基因交流可能是形成山核桃天然结构遗传结构的主要因素，研究结果符合山核桃风媒、异交的繁育系统特点和实际分布情况。邹雪梅采用RAPD对川西南高山峡谷区的核桃资源(109个样品)进行遗传多样性进行研究显示该分子标记产物能够显示核桃丰富的遗传多样性，聚类分析结果与地理区划基本符合(邹雪梅, 2006)。本实验通过采用RAPD分子标记技术对新疆的6个地方品种进行多样性的分析，最终可以将这六个核桃品种的母本分为3类，品种F₁代可以明显地划分为距离较远的两类，并且在F₁代之间存在着一定程度上的基因交流，与母本也存在着差异，这将为保存和育种提供一定的资源与信息。

3材料和方法
3. 1材料
实验材料为采自新疆轮台资源圃的母本材料(材料为当地农民自己嫁接, 品种名为: 轮1, 轮2, 轮3, 轮4,轮5, 轮6)和种植在石河子大学农学院实验站15号网室的F₁代单株(约190株)，以叶片为试材，春季待叶片展开后，对每个品种单株采新鲜嫩叶，提取总DNA。研究所用的 CTAB、PVP40、EDTA、Tris碱、Taq DNA聚合酶、dNTPs、琼脂糖等购自于上海生物工程技术有限公司，随机引物由北京三博远志生物有限责任公司合成，其它氯仿、乙醇、异戊醇、异丙醇等试剂皆为国产分析纯试剂。

3.2方法
3.2.1 DNA的提取与测定
DNA提取采用改良CTAB法，参照张虎平等(2003) (Cheng et al., 2003) (Proberki et al., 1997)的方法并稍加改动，提取的DNA经TE稀释100倍，用紫外分光光度计测定波长260 nm及280 nm处的光吸收值(OD值)，确定DNA的纯度和浓度，最后用TE稀释为20 ng/µL保存在-20℃备用。 

3.2.2引物筛选及PCR反应体系的确定
通过对张虎平(2003)、邹雪梅(2006)、杨恩(2006)已筛选出的55个随机引物进行再次筛选，选取扩增稳定，重复性好的引物用于试验。

PCR反应体系参照张虎平(2003)、邹雪梅(2006)的扩增体系，在试验了各种不同的扩增条件后，获得了适合于实验的扩增反应体系和循环条件，反应总体积为25 µL，各成分如下：10×Buffer (含Mg²⁺) 2.5 µL，dNTPs (10 mmol/L) 0.5 µL，引物1.87 µL，Taq酶(5 U/µL) 0.2 µL，DNA模板(20 ng/µL)1.5 µL，ddH₂O 18.43 µL。扩增反应程序为:94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，36℃退火1 min，72 ℃延伸90s，共42个循环；72 ℃延伸7 min。在冰盒上加完反应物后在微型离心机上微甩放入PCR仪中进行反应，反应完成后取扩增产物10 µL点入含EB的1.2%的凝胶中电泳，然后在凝胶成像分析仪下观察并记录结果。

3.2.3数据处理
RAPD扩增实验重复2次，统计所有能产生多态性位点的引物在六个核桃品种母本和F1代单株上扩增的总带数和多态性条带数。在电泳图谱同一RAPD位点上有电泳带的记为“1”，无带的记为“0”，做[0、1]矩阵输入计算机，统计总带数，共有带，计算多态性：多态性=(总带数-共有带)/总带数，采用SPSS 16.0软件进行分析，用欧式距离平方法计算遗传距离(D)，根据遗传距离采用非加权类平均法(UPGMA法)构建聚类分析图，对结果进行统计与分析。

作者贡献
叶春秀、牛建新是本研究的实验设计和实验研究执行人；叶春秀完成实验操作及数据分析，论文初稿的写作；吕建强、王林、李荣、张虎平参与实验设计，结果分析；牛建新是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(30560090)资助。作者感谢实验室同学在实验中给予的帮助和建议，感谢石河子大学果树生物技术实验室给予的技术支持。感谢同行评审人给予的评审建议和修改意见。

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