许多植物次生化合物的合成涉及到一个或多个羟基的甲基化过程(Schroder et al., 2002)。植物O-甲基转移酶(O-methyltransferases, OMTs)在次生代谢中具有重要作用，能够催化S腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)的甲基转移到许多受体分子的羟基，参与一些次生代谢产物的合成。植物的OMTs基于蛋白的氨基酸序列被分为两类(Joshi and Chiang, 1998)。I类OMTs中研究最多的是咖啡酰辅酶A(CoA)-Ｏ-甲基转移酶(caffeoyl coenzyme A OMTs, CCoAOMT)，它催化木质素合成前体咖啡酰CoA的甲基化生成阿魏酰CoA (Humphreys and Chapple, 2002)。II类OMTS，咖啡酸甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferases, COMTs)由于被认为参与S木质素的合成而受到广泛的研究。虽然名为COMT基因，咖啡酸并不是COMT酶喜欢的作用底物，它首选的作用底物是咖啡醛 (caffeoyl aldehyde)和5-羟基松柏醛(5-hydroxyconiferaldehyde) (Osakabe et al., 1999; Li et al., 2000; Dixon et al., 2001; Parvathi et al., 2001)；另外一些II类OMTs则催化黄酮、类黄酮、苯丙烷类和多酚类化合物的甲基化。目前，已经从很多物种中克隆了植物OMTs基因，它们的分子分析、共同特性和分类已经被综述(Ibrahim et al., 1998)。

玳玳花(Citrus aurantium)，又名玳玳橘、回青橙、回春橙，是芸香科柑桔属常绿灌木，分布于我国南部各地，多见于扬州、苏州。玳玳花春末夏初盛开，其花香浓郁，沁人心脾，为我国南方常见的香花植物。花蕾含挥发油，油中主要含柠檬烯(Limonene)、芳樟醇(Linalool)、牻牛儿醇 (Geraniol)、香茅醇(Citronellol)、缬草酸(Valericacid)等。迄今为止，还未见到有玳玳花中OMTs基因被克隆的报道。随着分子生物学技术和基因组科学的发展，Genbank数据库中的表达序列标签(expressed sequence tags, ESTs)信息日渐丰富，电子克隆(in silico cloning)正是基于数据库中大量已克隆测序的ESTs信息于近年来发展起来的一门快速克隆基因的新技术，其技术核心是利用生物信息学技术组装延伸 ESTs序列，获得基因的部分乃至全长cDNA序列进一步利用RT-PCR的方法进行克隆分析、验证。在本研究中，我们在利用同源克隆的方法从玳玳花的花瓣中获得了一个植物OMTs片段的基础上，利用电子克隆的方法推断出了序列全长，并经过RT-PCR和测序验证，同源比对发现与COMT基因具有较高的相似性而被命名为CaCOMT (GenBank登录号: HM641694)，最后，对它进行了序列分析和功能预测。

1结果与分析
1.1玳玳花COMT序列全长的扩增
以玳玳花花瓣的cDNA为模板，用OMT5和OMT3的引物组合进行PCR扩增，对250 bp左右的亮带切胶回收(图1A)，连接到pGEM-T载体，测序，获得玳玳花OMT序列片段。对NCBI的blastn结果表明，获得的OMT序列片段，与COMT基因序列有较高的同源性；对NCBI的EST数据库进行电子克隆最终获得玳玳花COMT基因序列全长，用全长引物COMTW5和 COMTW3进行RT-PCR验证，发现扩增得到的序列大小在1 000 bp左右，与预期大小基本相符(图1B)。测序结果表明，玳玳花COMT基因的ORF框为1 101 bp，与电子克隆推断的序列仅存在3个碱基的差别，但推断的氨基酸编码序列完全相同，命名为CaCOMT。

图1 玳玳花OMT基因的克隆 Figure 1 The cloning of OMT gene from Citrus aurantium

1.2 CaCOMT序列分析
利用DNAStar软件的EditSeq程序对玳玳花CaCOMT氨基酸组成、分子质量、等电点分析发现，CaCOMT蛋白分子量为39 985.27 Daltons，等电点为5.76，由366个氨基酸组成，其中，正电荷氨基酸(K, R) 33个，负电荷氨基酸(D, E) 41个，疏水氨基酸(A, I, L, F, W, V) 138个，极性氨基酸(N, C, Q, S, T, Y) 87个。在NCBI的CDD (Conserved Domain Database)数据库(网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)对 CaCOMT蛋白序列进行结构特征分析发现(图2)，从35到86个氨基酸为蛋白二聚化(Dimerisation)结构域，在许多植物甲基转移酶基因的N端存在，从104到341个氨基酸为甲基转移酶结构域，能够利用S腺苷甲硫氨酸作为甲基的供体。利用DNAMAN6.0和MEGA4.0软件对植物OMTS进行多重序列比对并利用NJ法构建系统进化树(图3)，结果表明，CaCOMT同CbCOMT、CbIEMT、NtOMT1、BpCOMT、EgCOMT、 RcOMT2、MsCOMT和AtCOMT聚为一类，与RcOMT2、MsCOMT和AtCOMT的亲缘关系最近，氨基酸之间相似性分别为79.7%， 77.3%，76.0%。多个OMT基因编码氨基酸序列多重比对结果表明(图4)，玳玳花COMT具有植物OMTs的5个保守结构域。

图2 玳玳花CaCOMT基因序列及推断的氨基酸 Figure 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of cDNA full lenth of CaCOMT from Citrus aurantium

图3 根据植物OMTs蛋白构建的系统进化树 Figure 3 Molecular phylogenetic trees based on the deduced amino acid sequences of plant OMTs

图4 不同植物OMTs基因编码氨基酸序列多重比对结果 Figure 4 Multiple alignment result of different plant O-methyltransferase

2讨论
早期研究认为COMT甲基化主要发生在羟基肉桂酸水平。COMT催化咖啡酸和5-羟基阿魏酸(5-hydroxyferulic acid)甲基化分别生成阿魏酸(ferulic acid)和芥子酸(sinapic acid)，芥子酸进一步参与S木质素的合成(Guo et al., 2001)。近几年研究表明，COMT催化的反应除了在肉桂酸水平进行外，还可在醛和醇的水平上发生(Osakabe et al., 1999; Li et al., 2000; Dixon et al., 2001; Parvathi et al., 2001)。故现在认为COMT在木质素生物合成中催化咖啡酸、5-羟基松柏醛和5羟基松柏醇甲基化分别生成阿魏酸、芥子醛和芥子醇；CCoAOMT催化咖啡酰CoA甲基化生成阿魏酰CoA。除此之外，COMT还参与了芳香化合物的合成，月季RcOMT2与COMT氨基酸具有高度的相似性，它除了可以利用咖啡酸作为底物外，还对芳香物质1,3,5-三甲基苯(1,3,5-trimethoxybenzene)合成的3个前体都具有一定程度的活性(Wu et al., 2003)。花香物质香草素(vanillin)合成的最后一步酶促反应被认为是3,4-二羟基苯甲醛的甲基化反应(Pak et al., 2004)。烟草的I类COMT对底物咖啡酸和3,4-二羟基苯甲醛的活性效率相当，而II类COMT对咖啡酸没有活性，只对3,4-二羟基苯甲醛具有活性(Maury et al., 1999)。3,4-二羟基苯甲醛虽然不是香草兰(Vanilla planifolia) COMT的首选底物，但也能够催化3,4-二羟基苯甲醛的甲基化反应(Pak et al., 2004)。又如，仙女扇(Clarkia breweri) COMT和IEMT ((iso) eugenol O-methyltransferase)的氨基酸相似性达到了83%，但两者具有完全不同的底物选择特性，IEMT使丁香酚和异丁香酚的甲基化生成芳香物质甲基丁香酚(methyleugenol)和异甲基丁香酚(isomethyleugenol) (Wang et al., 1997; Wang and Pichersky, 1998)。定点突变分析(Wang and Pichersky, 1999)和分子模型研究(Zubieta et al., 2002)揭示仙女扇COMT和IEMT几个底物绑定残基的不同决定了底物选择特性的不同。通过序列分析和同源比对，由于玳玳花COMT与上述基因间都有较高的同源性，因此，我们推测玳玳花COMT可能同时在木质素生物合成和花香物质代谢中起作用。

3材料和方法
3.1植物材料
玳玳花花瓣，取自苏州。

3.2总RNA分离及cDNA第一链和第二链的合成
开花期取其未开放的花蕾。

RNA 的分离按照北京天根生化科技有限公司RNAplant植物总RNA提取试剂的说明书进行。RNA沉淀室温干燥5~10 min，用DEPC水溶解，-75℃保存备用。cDNA第一链和第二链的合成参照SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit User Manual方法进行。

3.3玳玳花OMT序列片段的扩增
根据已知植物的OMTs基因信息，设计简并引物OMT5；5’-ATGT(A/C/T)GG(A/T/C/G)GG(A/T/C/G) GACATGTTT-3’和OMT3：5’ -GT(C/T)CTCTC(T/C)TTNCCHCC-3’，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以玳玳花花瓣的 cDNA为模板，用简并引物OMT5和OMT3进行甲基转移酶的PCR扩增。PCR反应体系：cDNA模板0.5 μL，10×PCR缓冲溶液5 μL，25 mmol/L的Mg²⁺ 4 μL，特异引物(20 μmol/L) 1 μL，锚定引物(20 μmol/L) 1 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL，加水到总体积50 μL。PCR程序：94℃预变性3 min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。PCR产物用AXYGEN公司的DNA凝胶回收试剂盒回收，回收的产物插入pGEM-T easy载体，转化大肠杆菌，菌落PCR筛选阳性克隆。碱裂解法抽提质粒，用EcoRⅠ进行单酶切鉴定和PCR鉴定后，重组质粒送上海博尚生物公司测序。

3.4玳玳花COMT序列全长的电子克隆及RT-PCR 验证
在同源克隆获得玳玳花OMT序列片段的基础上，利用blastn搜索NCBI的EST数据库，下载检索到的高相似性的EST序列，下载的EST进行第一次拼接，得到一个叠连群(contig)；将此contig在NCBI的EST数据库上重新搜索匹配序列，并下载匹配序列；再将匹配序列进行拼接，重复搜索、拼接，直到不能再延伸为止，最后获得1个玳玳花COMT基因的cDNA序列。设计引物COMTW5：5’-ACAAAATGGGTTCAACCAGTTC-3’和COMTW3：5’-TCCAGTAGAACAAAAGACTCAAGC-3’，以玳玳花花瓣的cDNA为模板，进行RT-PCR验证。获得的PCR产物用AXYGEN公司的DNA凝胶回收试剂盒回收，克隆至pGEM-T easy载体，转化大肠杆菌，菌落PCR筛选阳性克隆送上海博尚生物公司测序。

3.5序列分析
用DNAStar 软件EditSeq程序对玳玳花CaCOMT进行氨基酸组成、分子质量、等电点分析，并通过NCBI的CDD (Conserved Domain Database)数据库(网址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测 CaCOMT蛋白的保守结构域；利用DNAMAN6.0和MEGA4.0软件对CaCOMT进行序列分析并与数据库中植物OMTs进行同源序列比对、聚类分析，NJ法构建系统进化树。

作者贡献
张强是本研究的实验设计和实验研究的执行人，并和张晓伟完成数据分析，论文初稿的写作；李艳敏和王慧娟及王利民参与实验设计，试验结果分析；孟月娥是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由河南省基础与前沿技术研究计划项目(082300430100)资助。

参考文献
Dixon R.A., Chen F., Guo D., and Parvathi K., 2001, The biosynthesis of monolignols: a ‘‘metabolic grid’’, or independent pathways to guaiacyl and syringyl units, Phytochemistry, 57: 1069-1084 doi:10.1016/S0031-9422(01)00092-9

Guo D.J., Chen F., Inoue K., Blount J.W., and Dixon R.A., 2001, Downregulation of caffeic acid 3-O-methyltransferase and caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase in transgenic alfalfa: impacts on lignin structure and implications for the biosynthesis of G and S lignin, Plant Cell, 13(1): 73-88 doi:10.1105/tpc.13.1.73 doi:10.2307/3871154

Humphreys J.M., and Chapple C., 2002, Rewriting the lignin roadmap, Current Opinion in Plant Biology, 5: 224-229 doi:10.1016/S1369-5266(02)00257-1

Ibrahim R.K., Bruneau A., and Bantignies B., 1998, Plant O-methyltransferases: molecular analysis, common signature and classification, Plant Mol. Biol., 36: 1-10 doi:10.1023/A:1005939803300

Joshi C.P., and Chiang V.L., 1998, Conserved sequence motifs in plant S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferases, Plant Mol. Biol., 37: 663-674 doi:10.1023/A:1006035210889

Li L., Popko J.L., Umezawa T., and Chiang V.L., 2000, 5-Hydroxyconiferyl aldehyde modulates enzymatic methylation for syringyl monolignol formation, a new view of monolignol biosynthesis in angiosperms, J. Biol. Chem., 275: 6537-6545 doi:10.1074/jbc.275.9.6537

Osakabe K., Tsao C.C., Li L., Popko J.L., Umezawa T., and Carraway D.T., 1999, Coniferyl aldehyde 5-hydroxylation and methylation direct syringyl lignin biosynthesis in angiosperms, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 8955-8960 doi:10.1073/pnas.96.16.8955

Pak F.E., Gropper S., Dai W.D., Havkin-Frenkel D., and Belanger F.C., 2004, Characterization of a multifunctional methyltransferase from the orchid Vanilla planifolia, Plant Cell Rep., 22: 959-966 doi:10.1007/s00299-004-0795-x

Parvathi K., Chen F., Guo D., Blount J.W., and Dixon R.A., 2001, Substrate preferences of O-methyltransferases in alfalfa suggest new pathways for 3-O-methylation of monolignols, Plant J., 25: 193-202 doi:10.1046/j.1365-313x.2001.00956.x

Schroder G., Wehinger E., and Schroder J., 2002, Predicting the substrates of cloned plant O-methyltransferases, Phytochemistry, 59: 1-8 doi:10.1016/S0031-9422(01)00421-6

Wang J., and Pichersky E., 1999, Identification of specific residues involved in substrate discrimination in two plant O-methyltransferases, Arch. Biochem. Biophys., 368: 172-180 doi:10.1006/abbi.1999.1304

Wang J., and Pichersky E., 1998, Characterization of S-adenosyl-L-methionine: (iso) eugenol O-methyltransferase involved in floral scent production in Clarkia breweri, Arch. Biochem. Biophys., 349: 153-160 doi:10.1006/abbi.1997.0452

Wang J., Dudareva N., Bhakta S., Raguso R.A., and Pichersky E., 1997, Floral scent production in Clarkia breweri (Onagraceae) II. Localization and developmental modulation of the enzyme S-adenosyl-l-methionine: (iso) eugenol O-methyltransferase and phenylpropanoid emission, Plant Physiol., 114:213-221 doi:10.1104/pp.114.1.213

Wu S., Watanabe N., Mita S., Ueda Y., Shibuya M., and Ebizuka Y., 2003, Two O-methyltransferases isolated from flower petals of Rosa chinensis var. spontanea involved in scent biosynthesis, J. Biosci. Bioeng., 96: 119-128 doi:10.1016/S1389-1723(03)90113-7 doi:10.1263/jbb.96.119

Zubieta C., Kota P., Ferrer J-L., Dixon R.A., and Noel J.P., 2002, Structural basis for the modulation of lignin monomer methylation by caffeic acid/5-hydroxyferulic acid 3/5-O-methyltransferase, Plant Cell, 14: 1265-1277 doi:10.1105/tpc.001412