大白菜(Brassica rapa ssp. pekinensis)具有显著的杂种优势，而雄性不育系在制种过程中的应用是配制杂交种的理想途径。Feng等(1995)发现的大白菜核基因雄性不育材料，其不育株率和不育度均达到100%，并且植物学性状优良，是白菜类蔬菜作物理想的雄性不育源材料。根据“核不育复等位基因遗传假说”(冯辉等, 1995;Feng et al., 1998)，该类核不育材料的不育性受同一位点3个基因控制，即Msf>Ms>ms。为了使这类不育材料得到更为广泛的应用，冯辉等(2007)设计了大白菜核不育系定向转育方案，采用常规有性杂交、回交、自交等方法实施转育，通过与轮回亲本连续回交转育性状，利用与已知基因型的核不育材料测交鉴定入选植株的基因型，这种方法不仅可以转育不育基因，而且还能兼顾园艺学性状的转育。利用该方法已成功将大白菜核不育复等位基因转入多种白菜类蔬菜作物中，育成了新的雄性不育系(冯辉, 2007; 辛彬, 2009)。

由于该类不育材料特殊的遗传机制，在甲型“两用系”转育过程中，会出现表现型为全可育，而植株基因型却不同的群体(MsfMsf; MsfMs)，仅凭花期育性不能在当代区分植株基因型。为选择基因型为MsfMs的可育单株进行回交，只能通过测交鉴定基因型的方法，势必会增加工作量及延缓转育进程。分子标记辅助选择技术是通过利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择的现代育种技术，该方法可在不受环境和生育期限制的情况下进行早代选择，从而提高育种效率。沈向群等(2004)筛选到1个与恢复基因Msf连锁的RAPD标记。张淑江等(2008)获得1个与显性核不育基因连锁的SCAR标记。袁鹤等(2009)将大白菜雄性不育基因定位于4号染色体上。刘志勇(2010)开发了3个与不育基因Ms连锁的SCAR标记。王丽丽(2010)利用标记syau-scar01辅助选育了大白菜“a20”核基因雄性不育系。本试验以花心白菜可育品系‘宫古花蕊’为试材，利用核不育复等位基因遗传的白菜雄性不育材料为不育源，选择冯辉等(2009)开发的与该不育基因Ms连锁的SCAR标记syau-scr04进行辅助选择，育成了新的甲型“两用系”。

1结果与分析
1.1可育品系“Y02”基因型鉴定
以白菜核不育系06SX110(Msms)为母本，与可育品系“Y02”杂交，F₁代全部为可育株(可育株:不育株=96:0)，说明可育品系“Y02”的基因型为MsfMsf。

1.2标记syau-scr04在亲本间的多态性
经验证，标记syau-scr04扩增带型在不育源06SX090(MsMs)与待转育品系“Y02”之间存在明显的多态性(图1)，可用于Ms基因的分子标记辅助选择。

图1 标记syau-scr04在亲本间的多态性 注: M: DL2000 marker; Pf: 可育品系(MsfMsf); Ps: 不育株(MsMs) Figure 1 Amplification results of syau-scr04 in parents Notes: M: DL2000 marker; Pf: Fertile inbred line “Y02” (MsfMsf); Ps: Sterile plant (MsMs)

1.3不育基因Ms的分子标记辅助选择
利用测交方法鉴定BC₁群体基因型(表1)。对标记syau-scr04的准确性在BC₂群体中进行验证。随机选取BC₂群体 (MsfMsf和MsfMs)植株50株，利用标记syau-scr04对含Ms基因的植株进行辅助选择，同时50株植株与不育系(Msms)测交验证选择的准确性。结果表明，标记syau-scr04在22株植株中扩增出特异带(图2)，与测交鉴定结果一致(表2)，说明选择的准确率为100%，可应用于MsfMs基因型植株的分子标记辅助选择。

表1 BC1 MsfMs基因型鉴定结果 Table 1 The results of the genotype check for breeding male sterile line in BC1

表2 分子标记检测及测交鉴定验证BC2植株基因型结果 Table 2 Results of the genotype tested with syau-scr04 and testcross in BC2

图2标记syau-scr04鉴定BC2植株基因型结果 Figure 2 Results of the genotype tested by syau-scr04 in BC2

从BC₃群体中随机选取13株植株(至少7株)，利用标记syau-scr04进行扩增选择，选择结果表明，在第2、4、5、6、8、9、11号单株上扩增出清晰的特异带(图3A)；从BC₄群体中随机选取13株植株(至少7株)，利用标记syau-scr04进行扩增选择，选择结果表明，在第3’、4’、5’、7’、8’、9’、12’单株上扩增出清晰的特异带(图3B)，选择8’号单株自交，其后代育性出现分离(可育株：不育株为3:1)，遗传模式为：MsfMs→MsfMsf，MsfMs，MsMs。

图3 A: BC3 syau-scr04对基因型MsfMs的选择; B: BC4 syau-scr04对基因型MsfMs的选择 Figure 3 A: Selection results for MsfMs using syau-scr04 in BC3; B: Selection results for MsfMs using syau-scr04 in BC4

1.4新甲型“两用系”的配制
通过标记syau-scr04扩增选择可判断BC₄中8’号单株的基因型为MsfMs，其自交后代育性表现为3:1分离，在其自交后代群体中，选7株可育株与不育株进行兄妹交，兄妹交后代1:1分离，可断定基因型为MsfMs和MsMs，即新甲型“两用系”。遗传模式如下：MsMs×MsfMsf→MsfMs全可育(All fertile)；MsMs×MsfMs→MsfMs，MsMs 1:1 (可育fertile:不育sterile)。

2讨论
目前，分子标记辅助选择育种已在许多大田作物中得到了应用(Liang et al., 2004; Gao et al., 2008; Sang et al., 2006)。本试验将此方法应用于白菜类蔬菜作物甲型“两用系”转育过程中以加速转育进程。

根据大白菜雄性不育系定向转育模式，基因型为MsfMsf的可育品系宜采用雄性不育系(Msms)作为不育源进行转育(李承彧, 2009)。转育包含两部分的连续回交工作，一部分是MsfMs×MsfMsf，另一部分是Msfms×MsfMsf，回交后代育性都表现为全可育。这两部分都需要通过测交鉴定基因型后再回交。如果分别利用与Ms和ms连锁的分子标记鉴定出含有Ms和ms的植株，可以省去测交环节，从而减少工作量并加快转育进程。本研究利用标记syau-scr04辅助Ms基因的选择，研究开发与ms基因紧密连锁的标记是今后亟待解决的一项任务。白菜类蔬菜作物种植广泛，在核基因雄性不育系转育过程中，利用分子标记技术在苗期对植株基因型进行鉴定，可大大加速转育进程，减少工作量。

本试验利用标记syau-scr04辅助目的基因Ms的选择，最终育成了分离比例为1:1的花心白菜‘宫古花蕊’Y02甲型“两用系”。

3试验材料与方法
3.1亲本及不育源材料
不育源材料：白菜核不育系06SX110(Msms)，“两用系”的不育株06SX090(MsMs)。

转育目标品系：花心白菜‘宫古花蕊’Y02(MsfMsf)。

3.2用于辅助选择的标记
试验选择冯辉等(2009)开发的与不育基因Ms紧密连锁的SCAR共显性标记syau-scr04，引物序列：5′-AGGATATATCTTGGCTCACGAG-3′，3′-CATCAATAGTGGCGTATGTCTG-5′，该标记距离Ms基因的遗传距离为2.5cM，退火温度为58℃。

3.3 DNA提取及PCR分析
DNA提取采用的是改良CTAB法(Williamson et al., 1994)。PCR分析方法，10 μL体系：包括6.6μL灭菌水， PCR缓冲液(Mg²⁺) 1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.8 μmol，2.5 U/μL Taq聚合酶0.1 μL，0.5 μmol/L引物1 μL，2 ng/μL DNA 0.5 μL。PCR扩增程序为：预变性5 min (94℃)，变性1 min (94℃)，退火1 min (58℃)，延伸2 min (72℃)，循环30次，72℃延伸保持5 min。

3.4辅助选择转育路线
根据“核不育复等位基因遗传假说”(冯辉等, 1995;Feng et al., 1998)，基因型为MsfMsf的待转育品系应以核不育系(Msms)为不育源，设计甲型“两用系”定向转育遗传模式(图4)。通过与轮回亲本连续4代回交，实现基因型及植物学性状的同时转育，回交过程中会出现基因型不同的群体，表现型为可育，利用分子标记从群体中选择基因型为MsfMs的单株。选取基因型为MsfMs单株自交，自交后代兄妹交以获得甲型“两用系”。

样本容量按公式 n≥lg (0.01) / lg (1 - p) 计算，p为目标个体出现概率；适合性测验取公式 X²C = [ | A - ra | - ( r +1)/2 ]2/r.n。

图4 分子标记辅助选择转育白菜甲型“两用系”遗传模式 Figure 4 Genetic model for directional transfer of the multiple Allele inherited AB line typeⅠin Chinese Cabbage based on MAS

作者贡献
杨宁、李跃飞和刘志勇是本研究的实验设计和实验研究的执行人；杨宁完成数据分析，论文初稿的写作；李跃飞和刘志勇参与实验设计，试验结果分析；冯辉是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(31071792)和高等学校博士学科点专项科研基金(20092103110001)共同资助。作者感谢辽宁省十字花科蔬菜遗传育种重点实验室全体人员在本实验过程中给予的技术支持和有益建议。感谢两位匿名同行评审专家的评审建议和修改建议。

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