研究背景
棉花已经成为新疆的主要经济作物之一，而新疆干旱少雨的自然条件是影响棉花产量主要的非生物因素之一(周守华等, 2014)。干旱引起的水分缺失会导致棉花在生长发育、产量和品质等方面都受到不利影响(陈丽萍和何道一, 2010)。因此研究棉花的抗旱机制，提高棉花的抗旱性，对于新疆棉花产业的发展有重要的意义。
 

油酸素内酯(Brassinosteroid, BR)是最新发现一种与植物的发育和抗逆相关的植物激素。已有研究表明BR可以降低植物在非生物胁迫如干旱(阮英慧等, 2011)、高盐(刘金隆, 2013)和高温(曹云英和赵华, 2007)等条件的损伤。在BR信号通路中，GhBES1编码的BES1蛋白是一种重要的转录因子，去磷酸化的BIN2使得BES1蛋白去磷酸化后可以进入细胞核直接调控细胞内相关抗旱的基因的表达(He et al, 2005)。因此分析GhBES1基因的功能显得尤为重要，本研究采用病毒有诱导的基因沉默技术对GhBES1基因的功能进行了初步的研究。

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)是最近几年发现的转录后水平上的一种基因沉默技术，它是指将带有一段靶基因的重组病毒载体转入根瘤农杆菌(GV3101)侵染植物，引起植物体内同源基因的沉默或表型变异，进而通过生理指标测定指标和表型变异来分析该基因的功能(Burch-Smith et al, 2004)。该技术与传统的转基因技术相比较有周期短和高效实用等优点(王丽等, 2014)。当前已有用于棉花赤霉素合成酶基因功能验证的报道(Gao et al., 2011)。本实验通过VIGS技术沉默棉花‘新陆早17号’幼苗的GhBES1基因，研究PEG6000模拟干旱胁迫下的渗调物质、MDA、含水量以及叶绿素含量的变化，为进一步验证GhBES1的功能提供理论依据。

1结果与分析
1.1重组载体pTRV-GhBES1的构建
根据沉默干涉位点分析得到棉花GhBES1基因的干涉片段为650 bp，以棉花‘新陆早17号’叶片所提取的cDNA为模板，由设计特异性引物扩增后进行琼脂糖凝胶电泳(图1A)，在650 bp左右出现，扩增产物和pTRV-RNA2载体分别进行双酶切(KpnⅠ和XbaⅠ)后，进行回收、连接、转化(感受态为农杆菌GV31O1) (图1B)；测序鉴定出阳性克隆。

图1 pTRV-GhBES1的扩增和酶切鉴定 注: M: DL 2000 Marker; A: 1~2: pTRV-GhBES1的扩增；B: 1: pTRV-GhBES1重组质粒的KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定 Figure 1 The amplification and digestion identification of pTRV-GhBES1 Note: M: DL 2000 Marker; A: 1~2: The amplification of pTRV-GhBES1; B: 1: Identification of recombined plasmid pTRV-GhBES1 digested by KpnⅠ and EcoRⅠ

1.2 GhCLA1和GhBES1基因沉默效率的检测
相对于空载pTRV-00，pTRV-GhBES1植株的GhBES1的表达量只有pTRV-00植株的21% (图2)，由此表明棉花苗的GhBES1基因沉默成功。在PEG6000模拟干旱胁迫条件下，pTRV-00和pTRV-GhBES1植株的基因表达量分别是相对于非干旱胁迫下基因表达量的2.41和3.4倍。表明干旱胁迫下促进GhBES1的表达。

图2 沉默GhBES1对棉花叶中GhBES1的表达影响 Figure 2 Effect of silenced GhBES1 on expression of GhBES1 in the cotton

1.3 GhBES1基因沉默后植株含水量的检测
干旱胁迫24 h后，测量植株含水量(图3A)，相对于空载pTRV-00，pTRV-GhBES1植株的含水降低了5.4%，但无明显差异。
测量可溶性糖含量可知(图3B)，pTRV-00植株和pTRV-GhBES1植株可溶性糖含量有显著性差异(P=0.0221)。相对于pTRV-00植株，pTRV-GhBES1植株可溶性糖含量下降了39.51%。

图3 沉默GhBES1对棉花叶片的含水量和可溶性糖含量的变化的影响 Figure 3 Effect of silenced GhBES1 on the change of water content and soluble sugar content in leaves of cotton

1.4 GhBES1基因沉默后光和色素含量的测定
干旱胁迫24 h后，分别对空载pTRV-00和pTRV-GhBES1植株的叶绿素a、b、叶绿素a/b和类胡萝卜素进行了测量，与空载pTRV-00组相比，实验组的叶绿素a、b和类胡萝卜素含量分别降低了7.1%、15.6%和14.4%。而叶绿素a/b相反增加了12.01% (图4)。但与空载相比都没有显著性差异。

图4 沉默GhBES1对棉花的叶绿素含量的影响 Figure 4 Effect of silenced GhBES1 on chlorophyll content in cotton

1.5 GhBES1基因沉默后丙二醛(MDA)的测定
胁迫24 h后，采样分别测定pTRV-00和pTRV-GhBES1植株叶片的MDA含量，对照组pTRV-00组的MDA含量仅为沉默组pTRV-GhBES1的1.84倍，且有显著性差异(P=0.0249) (图5)。

图5 沉默GhBES1对棉花的MDA含量的影响 Figure 5 Effect of silenced GhBES1 on MDA content in cotton

1.6 GhBES1基因沉默后渗透调节物质的测定
干旱胁迫24 h后，分别测量pTRV-00和pTRV-GhBES1植株叶片的脯氨酸和甜菜碱含量，相对于空载pTRV-00，pTRV-GhBES1植株叶片的脯氨酸含量只有其空载的50.47%，且在极显著水平有差异(P=0.0053) (图6A)。相对于pTRV-00植株，pTRV-GhBES1植株甜菜碱含量下降了6.2%。二者之间含量无显著性差异(图6B)。

图6 沉默GhBES1对棉花的脯氨酸和甜菜碱含量的影响 Figure 6 Effect of silenced GhBES1 on proline and betaine content in cotton

2讨论
病毒诱导的基因沉默目前已经成功的应用于烟草(Ratcliff et al., 2001)、番茄(Liu et al., 2002)、辣椒(Chung et al., 2004)、矮牵牛(Chen et al., 2004)等，王丽等人最新也报道了利用VIGS技术对棉花幼苗GhCPS基因的沉默(Gao et al., 2011)。本实验参照的方法王丽等人的实验操作，用VIGS技术沉默GhBES1基因，对其基因的功能进行了初步摸索。实验流程为将棉花幼苗注射含有pTRV-GhBES1的重组载体35 d后，提取其总RNA后反转成cDNA，做Real time-PCR检测GhBES1基因的表达量，仅为空载pTRV-00的21%，表明GhBES1基因的沉默体系(VIGS)建立成功，后续在PEG6000模拟干旱胁迫下测定其生化指标来推测其基因的功能。

干旱胁迫下植物的生长发育变缓，其原因就是植物体内水分缺失，造成了渗调物质增加、膜脂过氧化损伤和离子毒害。Anjum等人的研究表明文冠果苗在干旱胁迫下，油酸素内酯(BR)处理增加了文冠果叶片的相对含水量、脯氨酸和可溶性糖含量(Anju et al ., 2011)。其BR信号通路中的GhBES1编码的BES1蛋白是植物防御的一种内源信号分子，植物在受到干旱或盐胁迫情况下可以诱导该基因的表达去抵御外界的胁迫(Krishna, 2003)。也有人报道GhBES1编码的BES1蛋白BR信号通路是一种重要的转录因子，去磷酸化的BIN2使得BES1蛋白去磷酸化后可以进入细胞核直接调控细胞内相关抗旱的基因的表达(He et al., 2005)。这与我们实验分析降低了棉花的抗旱性相一致，即沉默GhBES1使得棉花叶片的渗调物质游离脯氨酸和可溶性糖的含量分别降低了50.74%和39.51%。进而表明GhBES1基因很可能参与调控棉花抵御干旱相关基因的表达。

干旱胁迫下可以导致活性氧破坏膜脂的过氧化，其中丙二醛(MDA)是反映植物细胞膜损伤程度的重要指标之一。聂石辉等人(2011)的研究表明干旱胁迫不同程度的增加了大麦丙二醛的含量。我们测得沉默GhBES1的棉花苗的MDA含量相对于空载也显著增加，这一分析也进一步说明GhBES1基因在植物抵御抗旱胁迫中的重要作用。本实验也研究了沉默GhBES1基因对棉花的光合作用的影响，结果显示，实验组与空载组相比较，叶绿素含量及叶绿素光和效率(叶绿素a/b)变化不显著，这个分析很可能表明GhBES1基因的表达与棉花的光合作用系统无关。

随着BR可以提高植物抗旱性研究大量的报道，进一步研究BR提高植物抗旱的调控机制显的尤为重要。本研究利用VIGS技术沉默GhBES1基因，分析显示沉默GhBES1基因的棉花苗相对于空载的含水量、甜菜碱、脯氨酸、可溶性糖以及叶绿素含量都有一定的降低，膜脂过氧化程度(MDA含量)有一定的增加。表明GhBES1基因的表达很可能与棉花的抗旱机制调控有关。也表明了GhBES1可能是棉花的抗旱调节中发挥作用的一个基因。该结果也为进一步的阐明BR信号通路提供了理论依据。

3材料与方法
3.1实验材料
3.1.1沉默所用实验苗的处理
实验所用的棉花‘新陆早17号’种子由新疆农业科学院经济作物研究玛纳斯试验站提供。挑选籽粒饱满大小一致的棉花种子，用70%乙醇消毒1 min，蒸馏水冲洗3~4次,用15%过氧化氢浸种5 h，蒸馏水冲洗3~4次，播种到固体MS培养基中，进行无菌培养，10 d后打开封口膜炼苗两天，然后将棉花幼苗转至Hoagland营养液(木合热皮亚, 艾尔肯和张富春, 2011)中继续培养两到三天，以此时的棉花幼苗为实验材料。

3.1.2生理生化测定的棉花苗处理
注射完后计时，等到10~15 d时，注射pTRV-CAL1棉花幼苗的1~2片真叶陆续出现漂白现象，最终统计注射pTRV-CAL1的棉花幼苗白化率为25/30=83.34%，表明沉默成功。等到35 d时，用2.5%的PEG6000模拟干旱胁迫处理24 h后，分别采样，放置于-80℃冰箱，以备后续试验。

3.2 VIGS重组载体的构建与注射棉花
用于建立VIGS体系的pTRV (pTRV-RNA1和pTRV-RNA2)载体与携带CAL1基因的病毒载体由中国农业大学馈赠。植物的CLA1 (Cloroplastos alterados 1, CLA1)编码1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase)，参与叶绿体的发育过程，且此酶在进化中高度保守，棉花中此基因沉默后植株叶片表现出光漂白症状(Gao et al., 2011)，本实验以此基因作为VIGS体系操作成功与否的评价。

VIGS重组载体的构建：根据GHBES1干涉位点分析结果设计特异性引物，以CDNA为模板进行RT-PCR扩增，扩增产物和PTRV-RNA2载体分别进行双酶切(KpnⅠ和XbaⅠ)后，进行回收、连接、转化(感受态为农杆菌GV31O1)；测序鉴定出阳性克隆。

VIGS重组载体转化农杆菌GV3101：pTRV-RNA1、pTRV-RNA2、pTRV-CLA1、pTRV-GhBES1分别转化农杆菌GV3101。

VIGS重组载体注射棉花叶片的步骤如下：倒置培养36~48 h后，挑选单克隆与7 mL LB培养基(LB+50 μg/mL卡那霉素+50 μg/mL 庆大霉素)，28℃、200 r/min过夜培养；将菌液接种于50 mL YEB培养基(YEB+20 μmol/L 乙酰丁香酮+50 μg/mL 卡那霉素+50 μg/mL 庆大霉素+100 μmol/L MES)，28℃、200 r/min过夜培养，OD600=1.5；酶标仪测量菌液OD600=0.6左右时，将菌液置于无菌离心管，4 000 r/min，离心8 min，弃上清液，合并几次沉淀的菌体于无菌烧杯中；用转化液(YEB+200 μmol/L 乙酰丁香酮+10 μmol/L MES+10 μmol/L MgCl2)悬浮菌体至OD600=1.5；将pTRV-RNA1分别与pTRV-RNA2、pTRV-CLA1、pTRV-GhBES1的悬浮液等体积混合，置于室温3 h；棉花幼苗子叶平展，每株幼苗分别注射2片子叶，每片子叶注射10 mL左右，每组30株，3次重复。

3.3生化指标的测定
3.3.1 Gh CLA1和GhBES1基因沉默效率的检测
棉花幼苗注射完10 d左右，观察到pTRV-CLA1的处理苗出现白化现象，注射35 d后对空载对照(pTRV-00)和实验组(pTRV- GhBES1)棉花苗的第2片真叶，提取其总RNA，逆转录为cDNA，选用棉花的18 s为内参基因，GhBES1和Gh18s分别设计荧光定量PCR的特异性引物已列出(表1)。

表1 GhBES1和内参基因Gh18s的引物序列 Table1 Primer sequences of GhBES1and reference genes Gh18s

实时荧光定量PCR参照带有ROX的Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (美国Invitrogen公司)试剂盒说明书进行。RT-PCR反应参数为：94℃ 15 s；94℃ 30 s；59℃ 30 s；72℃ 45 s；40 cycles；72℃ 2 min。采用ABI PRISM 7500实时定量PCR仪进行RT-PCR及检测，数据采用2-ΔΔCt法进行分析。

3.3.2光和色素含量的测定
注射病毒后35 d后，用2.5%的PEG6 000干旱胁迫24 h，分别取pTRV-00和pTRV-GhBES1棉花幼苗的第二片真叶，测定其叶绿素a/b、总叶绿素和类胡萝卜素含量，具体方法参照(木合热皮亚, 艾尔肯和张富春, 2013)。

3.3.3含水量的测定
处理方法同上，采样后分别用相对含水量采用烘干法(姚世响, 2010)对其相对水含量进行测定。

3.3.4丙二醛(MDA)含量的测定
处理方法同上，采用硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量(王瑜, 2008)；电导仪检测叶片的电导率(姚世响, 2010)。

3.3.5渗透物质含量的测定
处理方法同上，采样后分别用酸性茚三酮显色法测定Pro含量(姚世响, 2010)；蒽酮比色定测定可溶性糖含量(姚世响, 2010)；雷氏盐法测定甜菜碱含量(姚世响, 2010)。

3.4统计分析
各个实验均为独立重复3次，实验数据的处理与作图均为GraphPad Prism 5软件处理分析。

作者贡献
安汶铠负责实验的实施与论文的撰写。常丹和杨艺参与了实验的设计与实施，张富春负责实验的设计、指导与论文的修改。

致谢
本研究由国家自然科学基金-新疆联合基金重点项目(U1303282)资助。

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