由专性寄生真菌小麦白粉菌(Erysiphe graminis.f.sp triticale)引起的小麦白粉病是小麦的主要病害之一，小麦感染白粉病后可导致穗粒数减少、粒重下降、品质变劣、产量降低。随着半矮杆小麦品种的推广和小麦生产水平的提高，白粉病在我国各麦区经常发生和流行，危害程度日趋严重，已成为影响和限制小麦高产、稳产、优质的一大障碍(王心宇等, 2001)。因此，发掘利用抗白粉病基因，筛选和培育抗病品种是防治小麦白粉病的有效途径。由中国从簇毛麦中发现定位的抗白粉病基因Pm21，是目前最为有效的抗病基因之一，其抗性强、抗谱广，能抗中国目前所有的白粉菌的菌系或生理小种，并且对120个欧洲小种也具有抗性(陈孝等, 1997; Huang et al., 1997)，它已被成功地转入到普通小麦中，并定位于6VS/6AL的短臂上(齐莉莉等, 1995)。

目前，报道的与Pm21基因连锁的分子标记主要包括以下四大类：RAPD、AFLP、SCAR和STS标记。如Qi等(1996)筛选到可以追踪Pm21的RAPD标记OPH17-1400，之后Liu等(1999) 进一步将其转化为与Pm21连锁的SCAR (sequence characterized applied region)标记SCAR-1400和SCAR-1265；李辉等(2005)用120个随机引物对6D/6V代换系Pm930640进行RAPD分析，获得5个 6VS 的特异标记；Cao等(2006)根据抗白粉病基因的序列开发出能鉴定6VS的共显性分子标记 NAU/XiBao15- 902 (CINAU15 – 902) ；Chen等(2006)根据小麦 LRR(leucine-rich repeat)序列开发出能鉴定 6VS 的共显性分子标记 NAU/ XiBao16 - 1085(即CINAU16- 1085)；王春梅等(2007)选用11个 RGA(Resistance Gene Analogy)和 17对STS引物筛选出分别位于6V短臂0.58~0.70和0.00~0.45区段的 CINAU17-1086 和CINAU18-723两个连锁标记；王振英等(2007)开发的RAPD引物(OPK08910)和AFLP引物(3对)可作为源自簇毛麦Pm21基因的选择标记。Wei等(2009)开发了一个能同时鉴定Pm12和Pm21的EST-SSR标记(XCAU127)。由于RAPD标记稳定性较低、重现性较差，限制了其在植物育种标记辅助选择中的应用；AFLP标记由于技术繁琐，费用昂贵且不易自动化，过程时间长，因此也限制了在植物育种标记辅助选择中的应用。目前，用于Pm21基因标记辅助选择的分子标记主要有SCAR1265(Liu et al., 1999)、SCAR1400(Liu et al., 1999)、CINAU17₁₀₈₆(王春梅等, 2007)、CINAU18₇₂₃(王春梅等, 2007)、STS标记CINAU15₉₀₂ (Cao et al., 2006)和CINAU16₁₆₅₀(Chen et al., 2006)。

本研究利用定位在第六部分同源群上的258个SSR、EST-SSR和STS标记对Pm21进行了连锁分子标记筛选，以期获得与Pm21紧密连锁的SSR、EST-SSR和STS等新型分子标记，丰富Pm21的分子标记类型，方便分子标记辅助育种。

1结果与分析
1.1小麦白粉病抗性鉴定
调查结果表明，在感病对照辉县红充分发病的情况下，抗病亲本CB033表现为免疫。在调查的213株CB033/辉县红F₂群体中，抗病单株153株，感病单株60株，经χ²检验(χ²=1.401<χ²0.05，P>0.05)差异不显著，抗病和感病单株的分离符合3:1的分离比例(表1)。

表1  CB033/辉县红F2代的遗传分析及卡方检验结果 Table 1  Chi-square text and genetic analysis of F2 derived from the cross between CB033 and Hui xianhong

1.2多态性引物的筛选
选用第六部分同源群上的258个SSR、EST-SSR和STS标记对亲本CB033和和辉县红进行标记的初次筛选，共获得102对多态性标记。利用筛选的多态性标记在F₂分离群体中进行优选小群体筛选，获得3对与抗白粉病基因pm21有连锁关系的特异性标记，分别是EST-SSR引物Xcfe164、 Xedm129和STS引物Xcinau188。Xcfe164在10个典型抗病单株中能够扩增出大小为123 bp的带，在10个典型感病单株中不能扩增出此带(图1A)；Xedm129在10个典型抗病单株中能够扩增出大小为233 bp、243 bp和321 bp的3条带，在10个典型感病单株中不能扩增出此3条带(图1B)；Xcinau188在10个典型抗病单株中能够扩增出大小为335 bp的带，在10个典型感病单株中不能扩增出此带(图1C)。
 

图1 分别为Xcfe164、Xedm129和Xcinau188在F2群体10个典型抗病单株和10个典型感病单株中的带型检测结果 Figure 1 Amplification products by Xcfe164, Xedm129 and Xcinau188 in resistant parent CB033 (P1), susceptible parent Hui xianhong (P2), 10 typical resistant individuals and 10 typical susceptible individuals of F2

1.3分子标记连锁分析
为了进一步检测上述3个标记是否与抗白粉病基因Pm21连锁，进一步利用F₂分离群体进行了连锁分析。结果表明，3个标记均与基因Pm21紧密连锁， F₂群体中抗、感基因型的分离都符合期望的分离比例3:1 (表1)；标记Xcfe164、Xedm129和Xcinau188与抗白粉病基因Pm21的连锁距离分别是3.75 cM、1.26 cM和0.98 cM (图2)。F₂部分单株的扩增结果(图3)。

图2  F2群体中抗白粉病基因Pm21的分子标记遗传连锁图谱 Figure 2  Linkage maps of the Pm21 in the F2 populations

图3  Xcfe164在部分F2群体的带型检测结果 Figure 3  Amplification products by Xcfe164 in resistant parent CB033 (P1), susceptible parent Hui xianhong (P2), part individuals of F2

1.4分子标记的验证
为了验证标记Xcfe164、Xcinau188和Xedm129的可靠性，利用共显性标记NAU/XiBao15- 902 (曹爱忠等, 2006) 在F₂选取纯合抗病单株和纯合感病单株种成F_2:3家系，进一步进行了抗病性鉴定和标记验证。结果表明，在调查的130株F_2:3家系中62株纯合抗病单株对白粉病均表现免疫，68株感病单株均表现感染(图4)；3个标记也均能扩增出相应的标记带。从而证明上述3个标记是可靠的。F_2:3家系部分单株的扩增结果(图5A; 图5B)。

图4  CB033和辉县红后代F2:3家系的抗性表现 Figure 4  Resistant performance of CB033 and hui xianghong’ derivetives

图5 Xcinau188在部分F2:3家系纯合抗病, 感病单株的带型检测结果 Figure 5 Amplification products by Xcinau188 in resistant parent Line CB033 (P1), susceptible parent Hui xianhong (P2), part pure resistant individuals of F2:3

2讨论
本研究筛选到与Pm21基因连锁的EST-SSR标记Xcfe164 、Xedm129和STS标记Xcnau188，丰富了Pm21基因的分子标记类型。由于EST是从cDNA文库中挑选克隆的基因表达序列片断，STS是根据单拷贝DNA片段两端的序列设计特异引物而扩增的特异序列，可以直接获得基因表达的信息，因此利用上述信息开发的EST-SSR和STS标记可靠性较好。本研究获得的上述3个标记与Pm21基因的遗传距离均较小，其中Xcfe164和Xedm129与Pm21基因的遗传距离分别为3.75 cM和1.26 cM， Xcinau188与Pm21基因的遗传距离为0.98 cM，因此它们在Pm21基因的标记辅助选择中具有利用价值，可用于标记辅助育种。本实验室利用上述3个标记进行Pm21基因的辅助选择也证明了它们的可靠性。

3材料与方法
3.1小麦材料
本实验所用的供试材料为含抗白粉病基因Pm21的小麦种质系CB033，普通小麦品种辉县红和辉县红与CB033杂交产生的F₁、F₂和F_2:3家系。抗病种质系CB033由中国农业科学院陈孝研究员惠赠，国家小麦改良中心泰安分中心保存。

3.2引物
选用覆盖小麦第六部分同源群上的258对引物，共包括三大类分子标记，即基因组SSR、EST-SSR和STS (袁园园等, 2010)。以上所有引物均由上海生物工程技术有限责任公司合成；10×PCR Buffer、dNTPs和Taq酶等均为大连宝生物工程有限公司产品。

3.3小麦白粉病抗性鉴定
利用感病亲本辉县红作为感病对照种成感染行，以白粉病E15菌种在感染行内接种，对F₁、F₂及F_2:3家系材料进行白粉病诱发感染；当辉县红充分发病时，调查亲本、F₁、F₂及F_2:3家系的白粉病抗性，分析各后代群体的抗、感分离情况。

白粉病分级标准为6级分级标准：
0型：免疫，植株无病斑；
0；型：坏死反应，叶片有枯死斑；
1型：高抗，病斑小(一般直径小于1 mm)，菌丝层稀薄可见绿色叶面，偶见较大病斑，但仍透绿，产孢量极少； 
2型：中抗，叶片病斑直径小于1 mm，但菌丝层较厚，不透绿，能产生一定量孢子； 
3型：中感，叶片病斑多，一般直径大于1 mm，菌丝层厚，产孢量大，但病斑不连片；
4型：高感，叶片病斑直径大于1 mm，菌丝层厚，产孢量多，病斑连片(详见盛宝钦，1988, 植物保护, 1: 49)，
其中0型，0；型，1型、2型为抗病，3型、4型为感病。白粉病E15菌种由中国农业科学院李洪杰博士提供。

3.4总DNA的提取
按照SDS-酚法提取植株幼嫩叶片的DNA (Devos et al., 1993)。

3.5 PCR扩增及电泳检测
反应体系为15 μL，扩增程序使用降落PCR (touchdown PCR)，扩增结束后10℃保存(袁园园等, 2010)。扩增反应所用仪器为美国Bio-Rad公司生产的9600 Thermal Cycler型热循环仪。扩增产物经8%非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳，硝酸银染色。

3.6标记分析
选用优选小群体分析法进行分析(Hao et al., 2008)，即选择典型的抗病单株10株(即白粉病级别为0或0;型的单株)和典型的感病单株10株(白粉病级别为4型的单株)分别提取总DNA，然后进行PCR扩增和电泳分析，寻找抗感性状(表现型)和扩增带型(基因型)基本一致的标记(选取标准参见宗浩等, 2009)，然后进一步在F2分离群体中进行验证，计算所筛得标记与基因(Pm21)之间的连锁遗传距离。利用卡方检验(χ²)，确定分离群体中观测值和期望值的符合度。微卫星标记与基因Pm21间的遗传距离用JoinMap软件进行计算，最后用MapDraw绘制遗传连锁图谱(刘仁虎等, 2003)。

作者贡献
作者亓晓蕾对本项研究做了主要贡献，包括最初的实验设计、引物的查询与合成、实验数据的分析及论文初稿的写作等；作者崔法参与了实验数据的初步处理和论文初稿的修改工作；作者余利参与了整个实验的过程；作者丁安明参与了实验数据的处理工作；作者李君与陈桂玲参与了实验的初步准备工作；作者王洪刚协调本项实验的顺利进行并参与了实验设计与论文的修改工作。所有作者均已阅读和赞同本文的最终稿。

致谢
感谢师兄郝元峰在本文论最初的构思中提出了非常有用的建议；感谢师妹包黎明与吴瑕在本实验过程中给予了大力帮助，使实验顺利完成；感谢陈孝研究员惠赠小麦种质CB033，为本实验提供了实验材料；感谢李洪杰博士提供了白粉病E15病菌，使本实验得到了准确的抗感分离结果。本实验所用的标记均来自GrainGenes2.0 及相关文献(文章中有说明)，并均由上海生工生物工程有限公司合成；本实验所用的10×PCR Buffer, dNTPs and Taq酶均由大连宝生物工程有限公司合成。中国农业科学院对本研究的部分工作给予了一定的支持，在此表示衷心的感谢。本论文所有权归山东农业大学所有，在此非常感谢国家自然科学基金(30771349)的资助。

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