小菜蛾(Diamondback moth)属鳞翅目菜蛾科，学名为Plutella xylostella，是一种世界性害虫。在我国南方广东、广西、海南等地发生较多。在对南宁无公害和常规菜区的植食性昆虫调查表明，感虫和受害严重程度的为十字花科类蔬菜，小菜蛾在十字花科蔬菜上一年四季为害，出现百株密度50头以上的达5月次以上(贤振华等, 2007, 中国植保导刊, 27(6): 25-27)。菜心(Brassica rapa var. parachinensis)，基因组为AA，是食用花薹器官的白菜变种。在华南地区栽培规模最大，具有极其丰富的种质资源。目前已经开展了白菜抗小菜蛾种质资源鉴定研究，对主要形态性状与抗性之间的相关性分析，发现叶面皱度与抗虫性存在一定的相关性，而其他性状与抗虫性关系不大(王海平等, 2005)。抗性遗传机制研究结果表明白菜对小菜蛾的抗性在不同生育期均稳定遗传，抗性遗传符合‘加性—显性’遗传模型，但以加性为主，经过六世代联合分析还发现F₂群体主基因遗传率达到41.11%以上(王欣等, 2007; 陆鹏, 2010)。

EST-SSR 是基于无内含子的cDNA序列的功能性分子标记，反映的是完整表达基因的部分信息，不但可以用来进行未知功能基因鉴定，同时也具有优良的种间通用性。如果与传统育种手段结合，能够提高杂交育种效率和精确性，加速育种进程，因而在白菜得的遗传多样性分析、种质鉴定和遗传图谱构建上得到广泛应用(忻雅等, 2006; 李丽等, 2009)。鉴于菜心种质资源丰富而小菜蛾抗药性的又不断提高，挖掘和利用菜心本身的抗虫基因资源以保证食品安全将成为菜心抗虫育种的一个重要方向。本研究前期进行了菜心抗小菜蛾种质资源鉴定，获得了一批抗虫性较强的材料并配置了杂交组合。为继续挖掘和有效利用抗虫基因和白菜类蔬菜EST资源，本研究选用经鉴定为一对显性抗虫基因控制的菜心F₂群体及亲本，首次利用EST-SSR进行菜心抗虫性遗传连锁分析，旨在获得抗虫种质相关的基因信息，为将来开展抗虫基因工程研究奠定基础。

1结果与分析
1.1菜心抗虫性鉴定
对抗虫亲本、感虫亲本及F₂代分离群体进行苗期抗虫性离体鉴定(图1)，结果表明98株F₂代群体后代出现了明显的分离，表现为抗虫和感虫性状，其中感虫24株，抗虫74株，卡方测验符合1:3预期结果(χ²=0.35, P>0.05)，符合孟德尔遗传规律，表明本菜心对小菜蛾的抗虫性是由显性单基因控制。

图1 菜心F2分离群体部分单株的抗虫性鉴定结果 Figure 1 The resistance identification for some F2 individulas of Caixin

1.2菜心抗虫性的遗传连锁分析
通过BSA法，从17对EST-SSR引物中筛选出多态性丰富的3对用于F₂分离群体的多态性分析(表1; 图2)，结果多态性比例为18%。3对引物ESTP3ESTP3-1，ESTP11ESTP11-1和ESTP13ESTP13-1扩增98株F₂代分离群体得到12个EST-SSR标记，命名为EST-SSR1~EST-SSR12，平均每对引物得到4个标记。将12个标记进行卡方检验，7个标记的卡方测验显著(χ²=0.31, P>0.05)，表明F₂群体中抗、感基因型分离符合期望的分离比例3:1，可以进行遗传连锁分析。其余5个偏分离标记卡方不显著，偏分离比例为42%，有3个偏向母本(60%)，1个偏向父本(20%)，1个偏向杂合体(20%)。

表1 EST-SSR引物碱基序列 Table1 The EST-SSR primer sequences

图2 EST-SSR引物ESTP013扩增抗虫, 感虫菜心亲本及F2分离群体结果 Figure 2 EST-SSR patterns displayed by a primer pair ESTP013

将7 个EST-SSR标记用MapMaker/EXP3.0软件处理，结果分为3个连锁群，编号为LG1至KG3。总长149.1 cM，包括7个标记，最大的连锁群47.2 cM，最小的为22.7 cM。标记间最大间距为37.9 cM，最小为9.3 cM，平均间距为24.85 cM。将各个标记的遗传距离输入MapDraw运行得到遗传连锁图(图3)。

图3 菜心EST-SSR分子标记遗传连锁图 Figure 3 Caixin EST-SSR genetic linkage map

2讨论
抗虫性是数量性状，但其抗性不是绝对的，由抗虫与感虫品种杂交获得的F₂和高世代的抗性水平较高且较不稳定(张文珠等, 1999)，如在白菜对小菜蛾抗性研究中发现F₂群体主基因遗传率达到41.11%以上，因此认为在抗虫育种中应充分利用F₂群体并进行早世代选择以提高效率(王欣等, 2007; 陆鹏, 2010)。本研究采用离体方法鉴定菜心F₂分离群体抗虫性，发现抗虫亲本对感虫亲本的抗性是由显性单基因控制，这是与已有的研究结果不同的(王欣, 2007; 陆鹏, 2010)，原因可能在于材料和研究方法的差异。抗性材料之间遗传背景的差异，及同一份材料鉴定方法的差异都可能影响抗性鉴定结果(王海平等, 2005; 陆鹏, 2010)。在大豆抗食心虫的研究结果也证实，不同抗性亲本携带的抗虫基因可能是不同的，大豆F₂代的抗虫性虽然不具有数量性状特有的中心对称分布特征，但是选择效果比其它数量性状更有效(孙志强等, 1989)。本研究选用F₂群体研究菜心抗虫性遗传在于其构建时间短，遗传基础丰富，基因型随机分离，没有自然和人为选择干扰，误差低，还可同时估算数量性状的其它效应值等，能够迅速了解抗虫分离群体基本特性，为构建永久群体奠定基础。

SSR 标记是基于基因组DNA的结构性分子标记，具有操作简单和共显性遗传等优点，缺点是位点少、多态信息量低、引物合成和测试耗时耗费大、不能提供基因信息等。目前利用SSR和其它分子标记构建了很多白菜类的遗传连锁图谱(原玉香等, 2009; 成妍, 2009)，国际上也建立了基于SSR标记的白菜图谱(Kim et al., 2006; Suwabe et al., 2006)，但是由于使用的作图群体和标记均不相同，图谱之间的整合还是一个亟待解决的问题。菜心和拟南芥、白菜之间亲缘关系接近，与利用结构性分子标记构建的白菜遗传图谱和拟南芥图谱相比(Kim et al., 2006; Suwabe et al., 2006; 成妍, 2009)，本研究首次利用ESR-SSR构建的功能性分子标记遗传图谱群体较小、标记较少、连锁群较少、长度较短和偏分离比例较大，原因之一是选用的EST-SSR引物对数量仍不够，二是引物设计序列为具有时空表达特性和无内含子的cDNA，多态性远不如基于基因组的SSR引物丰富，为此需要将ESR -SSR与其它标记相结合才能构建更精细的图谱。

在育种研究中数量性状依赖于材料本身，应用上限制较多，不如单显性基因运用方便。利用EST-SSR进行分子遗传连锁分析不但能够直接反映基因的功能信息，而且可以直接克隆差异片段获得目的基因片段，极大地提高了育种效率和水平，本研究将 EST-SSR应用于菜心抗虫性图谱构建，为进一步开展抗虫基因定位、分离、功能验证等研究提高了可能性。

3材料与方法
3.1供试材料
供试小菜蛾为湖南农业大学提供的敏感种群，在广西大学昆虫研究所饲养至3龄供抗虫试验使用。菜心抗虫亲本Caixin65和感虫亲本Cxixin69亲本均经过田间自然鉴定和离体鉴定，自交多代。2010年秋将两亲本经人工去雄和杂交套袋授粉配制为F₁，同年加代自交抗性F₁单株。2010年春将种植F₂群体98份及亲本2份用于菜心EST-SSR分子标记分析。

3.2菜心抗虫性鉴定
菜心两亲本及F₁、F₂群体的抗虫性鉴定采用离体方法，抗性调查及分级标准参考王欣等(2007)。Microsoft excel 2003软件进行数据统计和卡平方适合度测验显著性。

3.3菜心基因组DNA的提取及EST-SSR反应体系建立
菜心总DNA提取采用CTAB法(Doyle et al., 1987)。

EST -SSR引物设计，下载NCBI十字花科芸薹属表达序列标签(Expressed Sequence Tag, EST) 13 747条，利用SSR hunter搜索和查找SSR，再根据结果的同源性和频率高低，选择与抗性与抗逆相关基因EST，采用primer3.0 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)设计引物。

反应体系20 μL：1× PCR buffer 2 μL、Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL) 1 U、dNTP (2.5 mmol/L) 0.4 μL、positive primer (10 μm/μL)、reverse primer (10 μm/μL) 1 μL，DNA (50 ng/μL) 2 μL，ddH₂O 12.6 μL。反应条件参考李丽等(2009)：72℃ 3 min，94℃ 2 min；94℃ 1 min，68℃ 1 min，72℃ 45 s (-1℃/2 cycles)；20 cycles；94℃ 1 min、58℃ 1 min、72℃ 45 s，72℃ 10 min。聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色。引物、Taq聚合酶、dNTPs和DNA Marker均购自上海英骏生物技术有限公司。

3.4遗传连锁分析
按分离群体分组(bulk segregation analysis, BSA)分析法(Michelmore et al., 1991)，将F₂群体单株分别提取基因组总DNA，随机选取10个抗虫单株和10个感虫单株，分别等量混合DNA建立抗虫池和感虫池，然后筛选在亲本抗、感池间表现多态性的EST-SSR引物对，再利用这些多态性引物分析F₂分离群体多态性。Mapmake3.0软件计算扩增位点和目的基因的遗传距离并构建图谱，Mapdraw软件绘制连锁图谱(刘仁虎等, 2003)。

作者贡献
史卫东是本实验设计者和负责人，预备实验，数据分析，论文写作与修改。梁育喆和周建辉均为实验项目的执行人；贤振华指导抗虫性鉴定。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本实验获得了广西农业科学院基本科研业务项目(200805Z)和广西自然科学基金面上项目(2010GXNSFA- 013084)的支助。

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