研究背景

基白菜类蔬菜是十字花科(Brassicaceae)芸薹属(Brassica)植物中重要的蔬菜作物，是人们所需营养的重要来源之一，其栽培面积居中国各类蔬菜之首，在蔬菜周年生产和供应上有着极其重要的地位，在全国蔬菜年供应量中达到了30% (张德双等, 2015)。中国是白菜类蔬菜的起源及分化中心之一，在长期的栽培驯化中形成了很多亚种或变种，主要包括白菜、塌棵菜、紫菜苔、油菜、菜心、青菜和芜菁等(郭晶心等, 2002; 林建丽等, 2008)。为了满足市场对白菜类蔬菜日益增长的需求，如何有效利用我国丰富的白菜类蔬菜种质资源，优化其种质资源、提高白菜类蔬菜的产量成为科研工作者研究的热点。从分子水平探究白菜类蔬菜的起源、进化及遗传多样性，不仅可以为白菜类蔬菜的保护与利用提供依据，还可以为芸薹属蔬菜间远缘杂交创制白菜类蔬菜新材料提供指导。孙德岭等(2001)和郭晶心等(2002)分别利用AFLP标记分析了不同白菜类蔬菜品种之间的分类关系，均认为芜菁与它他白菜类蔬菜遗传距离较远。何余堂等(2003)研究认为北方小油菜较南方油白菜原始，冬油菜较春油菜原始，关中蔓菁较北方小油菜原始。宋顺华等(2006)利用RAPD标记将64份大白菜资源分为6个类群，小白菜和芜菁各分成1类。基于RAPD分子标记，林建丽等(2008)将白菜类蔬菜分成2类10组，认为应将白菜和芜菁作为白菜类蔬菜的两个亚种，大白菜为白菜的一个变种。刘冬媛等(2014)利用SSR 标记将191份不结球白菜分成6类，聚类结果与材料地理来源密切相关。方彦等(2015)利用SSR和InDel标记将19份白菜型油菜分成2大类群、4个小群。马晓静等(2015)利用SSR分子标记分析了来自中国和日本的20个青菜品种间的亲缘关系，将20个青菜品种可分为3大类。但尚未见白菜类蔬菜起源进化及遗传多样性的分子系统学研究。

查尔酮合成酶基因(Chs)是单拷贝核基因，是植物类黄酮物质合成的第一个关键性基因，查尔酮合成酶在植物花粉育性、生长素运输、UV防护、抗病机制等方面有着十分重要的作用。植物的基因组中都有Chs基因，现认为在陆生植物中最早出现Chs基因。自第一个荷兰芹的Chs序列被发表后，科研工作者已经陆续在多种植物中发现并克隆了Chs基因，如玉米、矮牵牛、兰花、金鱼草、拟南芥、大豆和松树等(张必弦等, 2012)。Zhang等(2010)利用Chs基因分析了十字花科60个属106个种之间的系统关系，基于ML系统发育树的聚类结果能将十字花科不同种较好的区分开。本研究通过对中国白菜类蔬菜Chs基因的克隆、测序，分析Chs基因的遗传多态性，研究白菜类蔬菜不同变种间的分子系统发育关系，为白菜类蔬菜的起源进化提供分子证据，为白菜类蔬菜远缘杂交及品种改良提供依据。

1结果与分析

1.1 Chs基因序列多态性分析

将获得16份Chs基因进行比对，结果表明白菜类蔬菜Chs序列长度变异范围为1 203~1 477 bp，平均长度为1 433 bp。Chs基因序列排序后，共得到1 504个排列位点，其中保守位点1 246个，占82.84%，可变位点236个，占15.69%，简约信息位点100个，占6.64%。序列比对分析表明(图1)，黑芥在1 004~1 007 bp处、1 374~1377 bp处分别发生了3 bp (AAA)和3 bp (CGA)的插入，在1 297~1 303 bp处发生6 bp (AGTTAC)缺失；涪陵红心萝卜和胭脂萝卜在995~1 000 bp、1 037~1 042 bp处分别发生了5 bp (TATTA)和5 bp (CAAAT)的插入，在1 341~1 351 bp处发生10 bp (TGTGTATATA)缺失；胭脂萝卜在1 009~1 018 bp处和1 020~1 023 bp处发生了变异；山东甘蓝在1 310~1 328 bp处发生18 bp (TGATCAATGCGTGACTTT)缺失。

图1 Chs基因序列对比部分分析 注: A: 发生在996~1 054 bp之间的插入/缺失; B: 发生在1 297~1 378 bp之间的插入/缺失 Figure1 Partial analysis of the Chs sequences comparison Note: A. The insertion/deletion occured at 996~1 054 bp; B: The insertion/deletionoccuredat 1 297~1 378 bp

1.2系统发育树分析

采用最大似然法(ML)构建系统发育树，其中4种碱基频率为：A为23.78%，T为24.11%，C为25.05%，G为27.05%，似然值为-2832.654，γ形值(gamma shape parameter)为0.06321。将18个Chs基因序列成4个分支(图2)。其中EF408922.1为A基因组(B. rapa)序列，GB983033.1为B基因组(B. nigra)序列，均从NCBI网站下载。R分支为外类群萝卜属不同种。A、B和C分支为芸薹属植物，其中B分支为黑芥(B. nigra)，C分支为甘蓝(B. oleracea)，B、C分支为白菜类蔬菜的近缘植物。A分支为不同类型的白菜类(B. rapa)蔬菜。A分支可分为A1和A2两个亚支，A1分支又可分为a和b两个支系，a支系包括山东白菜、序列EF408922.1、塌棵菜、雅安白菜和紫菜苔，b支系包括重庆白菜和伊犁野生油菜；A2分支分为c和d两个支系，c支系只包括广西菜心，d支系包括青菜、雅安黄油菜、芜菁和涪陵野生油菜。结果表明，不同基因组Chs序列能较好聚在一起，但同一基因组内变种间有相近的遗传关系，多数变种聚居在同一支系，不同白菜类蔬菜间的亲缘关系较近。

图2 白菜类蔬菜ML系统发育树 Figure 2 Phylogenetic tree of Chinese cabbage vegetable

1.3系统发育网络分析

用Splitstree 4软件，采用二分裂法，构建白菜类蔬菜不同变种、近缘植物和外类群萝卜属的网状进化式样。可将18个Chs基因序列分成4个明显的分支。A1和A2分支全为A基因组Chs序列，A1分支包括雅安白菜、重庆白菜、山东白菜、塌棵菜、青菜和涪陵野生油菜，A2分支包括广西菜心、芜菁、雅安黄油菜、紫菜苔和伊犁野生油菜。B分支包括黑芥和序列GQ983033.1，R分支包括涪陵红心萝卜和胭脂萝卜。聚类结果与系统发育树的聚类结果基本一致。除了支状的进化关系外，不同白菜类蔬菜变种间还存在大量的网状进化关系，在白菜类蔬菜栽培、驯化中存在较多的杂交事件(图3)。

图3 白菜类蔬菜的网状进化式样 Figure 3 The reticulate evolution pattern based on Chs sequences

1.4网状进化关系分析

白菜类蔬菜Chs基因序列网状结构显示了4个主要的分支(图4)，R分支为外类群萝卜属，B和C分支为白菜类蔬菜近缘植物，A分支全为白菜类蔬菜。A分支可分为A1、A2两个亚支，A1亚支包括广西菜心、青菜、雅安黄油菜、芜菁和涪陵野生油菜，A2亚支包括山东白菜、塌棵菜、雅安白菜、紫菜苔、重庆白菜和伊犁野生油菜。A1亚支中的白菜类蔬菜亲缘之间关系较近，A2亚支中除了标准序列EF408922.1之外，其它品种之间亲缘关系较近。

图4 基于Chs基因序列构建的MJ网状支系 注: 各节点间的数字表示突变位点数, mv后的数字是假定缺失的单体模本 Figure 4 Median-joining (MJ) network derived from the sequences of Chs gene Note: The numbers between points indicate the number of mutation steps; The numbers after mv is the missing intermediate haplotypes that were not found in the analyzed individuals

2讨论

2.1白菜类蔬菜遗传多样性评价

育种材料的遗传多样性是育种者较关心的问题，丰富的遗传多样性意味着在在品种改良和选育过程中有更多可供选择和利用的基因，了解育种材料的遗传差异，有利于育种中扩大种质来源以及更好地利用种质资源(楼珏张等, 2015)。从Chs基因序列对比结果来看，11份白菜类蔬菜的Chs基因序列没有大于3 bp的插入/缺失，说明白菜类蔬菜的Chs基因是一个非常保守的基因，在进化过程中发生变异的可能性小。从系统发育树来看，11份白菜类蔬菜材料分为两大类。从网状进化式样的分析看，11份白菜类蔬菜也被分为两类，但它们的网状支系距离都很短。从MJ网状支系分析结果看，可将11份白菜类蔬菜分为两类且每个品种之间的变异结点较近。以上研究结果均表明，11份白菜类蔬菜之间的遗传差异较小，亲缘关系较近，遗传背景相对狭窄。研究结果与郭晶心等(2002)、刘冬媛等(2014)和楼钰张等(2015)研究认为白菜类蔬菜之间的遗传背景很复杂的观点相反，这可能与采用的标记技术不同和所选的材料不同有关。由于原始的白菜类蔬菜品种已经在自然选择过程中被淘汰，加之人们在种植过程中倾向性地选择，从而导致了其遗传背景相对狭窄。在今后的白菜类蔬菜的育种过程中，应注重育种材料遗传基础的扩增，并加强白菜类蔬菜与其近缘植物的基因交流以扩宽其种质基础。

过程中有更多可供选择和利用的基因，了解育种材料的遗传差异，有利于育种中扩大种质来源以及更好地利用种质资源(楼珏张等, 2015)。从Chs基因序列对比结果来看，11份白菜类蔬菜的Chs基因序列没有大于3 bp的插入/缺失，说明白菜类蔬菜的Chs基因是一个非常保守的基因，在进化过程中发生变异的可能性小。从系统发育树来看，11份白菜类蔬菜材料分为两大类。从网状进化式样的分析看，11份白菜类蔬菜也被分为两类，但它们的网状支系距离都很短。从MJ网状支系分析结果看，可将11份白菜类蔬菜分为两类且每个品种之间的变异结点较近。以上研究结果均表明，11份白菜类蔬菜之间的遗传差异较小，亲缘关系较近，遗传背景相对狭窄。研究结果与郭晶心等(2002)、刘冬媛等(2014)和楼钰张等(2015)研究认为白菜类蔬菜之间的遗传背景很复杂的观点相反，这可能与采用的标记技术不同和所选的材料不同有关。由于原始的白菜类蔬菜品种已经在自然选择过程中被淘汰，加之人们在种植过程中倾向性地选择，从而导致了其遗传背景相对狭窄。在今后的白菜类蔬菜的育种过程中，应注重育种材料遗传基础的扩增，并加强白菜类蔬菜与其近缘植物的基因交流以扩宽其种质基础。

2.2白菜类蔬菜系统发育关系分析

白菜类蔬菜在中国广泛种植且与人们的生产生活息息相关。许多学者在白菜类蔬菜的分类及起源等方面做了大量研究。本研究将供试的白菜类蔬菜材料分为两大类，第一类包括山东白菜、塌棵菜、雅安白菜、紫菜苔、重庆白菜和伊犁野生油菜，相对较进化；第二类包括广西菜心、青菜、雅安黄油菜、芜菁和涪陵野生油菜，相对较原始。结果表明结球白菜和不结球白菜并未完全的分开，塌棵菜和结球白菜聚在一起，重庆白菜和伊犁野生油菜聚在一起，这与孙德岭等(2001)认为结球白菜与不结球白菜遗传差异较大的结果不一致。芜菁和不结球白菜聚在一起，与孙德岭等(2001)、郭晶心等(2002)和林建丽等(2008)的研究认为芜菁与其它白菜类蔬菜遗传差异较大的观点不一致。在大白菜的起源、进化方面有两种观点，一种观点认为大白菜是由小白菜与芜菁自然杂交进化而来，另一种观点认为大白菜是从普通白菜中分化而来(郭晶心，2002)。本研究网状支系分析中网状结构图没有显示明显的星状结构，说明所选材料中没有白菜类蔬菜进化的共同祖先，11份白菜类蔬菜之间都是平行进化的。从网状进化式样分析中发现供试的不同白菜类蔬菜变种间除了支状的进化关系外，不同白菜类蔬菜变种间还存在大量的网状进化关系，说明在白菜类蔬菜栽培、驯化中存在较多的杂交事件。这可能与白菜类蔬菜品种之间不存在生殖隔离，可以相互杂交有关。研究结果支持谭起猛的“分化起源”假说，认为现代栽培的白菜类蔬菜是由更加原始祖先进化而来。

3材料与方法

3.1试验材料

以11份具代表性的白菜类蔬菜品种、1份新疆黑芥品种、2份甘蓝类蔬菜品种和2份萝卜属品种作为研究材料(表1)。

表1 材料来源及Chs基因序列登录号 Table 1 Geographical origin of the Brassica rapa accessions and Genebank number of Chs sequences

3.2 DNA提取

在培养箱中发芽供试材料种子，各材料取黄化幼苗叶片约3 g在液氮中研磨，采用2×CTAB法抽提并纯化基因DNA (Doyle and Doyle, 1986)。

3.3 PCR扩增及DNA测序

经过PCR扩增后，得到的片段是Chs基因的第1和2外显子，序列长度大在1 200 bp左右。Chs基因扩增引物序列为：Chs-F: 5'-CTTCATCTGCCCGTCCATCATACC-3'，Chs-R: 5'-GGAACGCTGTGCAAG AC-3'(Zhang等, 2010)，PCR扩增体系为：12.5 μL 2×Taq MasterMix，上、下引物各2 μL，DNA 1 μL，RNase Free Water 7.5 μL，共25μl。将PCR扩增程序为：95℃变性5 min，1个循环；95℃变性60 s，55℃退火60 s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min；12℃保存。电泳后利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒对目的PCR产物进行回收和纯化。并将纯化后的扩增产物连接到质粒载体PMD18-T(TaKaRa)上，再转染感受态大肠杆菌菌株DH5a，在含有氨苄青霉素的培养基上培养大肠杆菌感受态菌株，挑取3~5个阳性克隆，最后再进行DNA测序。测序由上海生工生物工程有限公司完成。

用DNAman6.0进行序列比对，设计不同基因组Chs基因的特异引物。筛选到A基因组特异引物为 5'-GCA TTG ATC AAC CTC TTG TAA CT-3' (上引物)，5'-GGA ACG CTG TGC AAG AC-3' (下引物)。B基因组特异引物为：5'-TTG CAT AAA GTC ACA CAT CC-3'(上引物)，5'-GGA ACG CTG TGC AAG AC-3' (下引物)。

3.4数据分析

利用ClustalX(2.0)对白菜类蔬菜Chs基因序列进行多重排定和手工校正(Thompson et al., 1997)，将获得的序列上传至NCBI网站，获得白菜类蔬菜的Genebank号(表1)。使用DNAMAN 软件包(version 6.0；Lynnon Biosoft)进行序比对分析。采用PAUP4.0b10(Swofford D L, Sinauer Associates, http://www.sinauer.com) 软件中的最大似然法(Maximum likelihood, ML)构建系统发育树，利用MrBayes3.1.2软件分析进行模型和参数估计(Huelsenbeck and Ronquist, 2001)。采用系统网状重建法(The phylogenetic network reconstruction method)分析种群单体型的系谱关系。首先利用HyPhy软件中的GARD方法分别检测Chs基因外显子、内含子及外显子+内含子的重组信息，结果表明Chs基因外显子为非重组DNA序列(Log Likelihood=-5816.39, AIC=47251.54)，利用外显子序列数据资料构建网络支系图(Bandelt et al., 1999; Pond et al., 2005)。采用Network 5.4.4.0软件(Fluxus Technology Ltd, Clare, Suffoik, UK)中的中介连接网络法(The median-joining network method)进行网状支系分析。

作者贡献

陈发波是本研究的实验设计和实验研究的执行人；方平完成数据分析，论文初稿的写作；熊正贵和敖向建参与实验设计、实验结果分析；姚启伦是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改；毛毅和李红艳参与Chs基因克隆与测序。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由教育部科技司资助项目(Z2011143)、重庆高校创新团队建设计划资助项目(KJTD20132)、重庆市教委资助项目(KJ121304)和重庆市涪陵区科委计划资助项目(FLKJ, 2012ABB1085)共同资助。

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