炭样小单孢菌(Micromonospora carbonacea)，在分类学上属于小单孢菌属(Buchanan and Gibbons, 1984)。研究发现，炭样小单孢菌产生的次级代谢产物具有抗菌、抗肿瘤及免疫调节等多种生物活性(Sanders and Sanders, 1974; 江红等, 2007)，因而受到国内外学者广泛关注。

本实验室在前期研究中获得一株具有广谱抗菌活性的炭样小单孢菌JXNU-1(M. carbonacea JXNU-1)，其发酵产物对革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌均具有很强的抗菌活性(龙中儿等, 2008a; 戴菲等, 2011; 彭伟梦等, 2013)。同时，研究了炭样小单孢菌JXNU-1发酵产抗生素的工艺，掌握了该菌发酵产抗生素的条件及其作用规律(朱跃进等, 2006)建立了从该菌发酵液中分离纯化抗生素的方法，该抗生素经初步分析确定为一核苷类抗生素(龙中儿等, 2008b) (本研究将其定名为抗生素JX)，与文献报道的炭样小单孢菌活性产物明显不同，但其抗菌机理仍不清楚。

嗜根考克氏菌(Kocuria rhizophila)，原名藤黄微球菌(ATCC9341)，是药敏实验的常用靶菌之一(Tang and Gillevet, 2003)。本研究以抗生素JX为研究对象，以嗜根考克氏菌为靶菌，研究抗生素JX对噬根考克氏菌肽聚糖合成的影响，同时运用同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技术与纳升液相色谱和串联质谱(Nano liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Nano LC-MS/MS)技术高通量地筛选与肽聚糖合成相关的差异表达蛋白，并应用实时荧光定量-PCR进行验证，为揭示抗生素JX的抗菌机理提供实验依据，对炭样小单孢菌抗生素的研发具有重要意义。

1结果与分析

1.1抗生素JX作用下嗜根考克氏菌的细胞形态

最低抑菌浓度是测量抗菌药物抗菌活性大小的一个指标，试管二倍稀释法是测定抗菌药物最低抑菌浓度的一种常见方法。本研究首先运用试管二倍稀释法分析了抗生素JX对噬根考克氏菌的的最低抑菌浓度(Minimum inhibition concentration,MIC)为3.64 ug/mL。然后考察了嗜根考克氏菌在最低抑菌浓度的抗生素JX作用下的细胞形态，在抗生素JX作用下，噬根考克氏菌的细胞体积明显增大(图1)。

图1 炭样小单孢菌抗生素JX对嗜根考克氏菌细胞形态的影响(×5 000) Figure 1 Effect of the antibiotics JX from M. carbonacea JXNU-1 on morphology of K. rhizophila (×5 000)

1.2抗生素JX对嗜根考克氏菌细胞壁含量的影响

实验分析了嗜根考克氏菌分别在0、1/2MIC、4/5MIC和MIC的抗生素JX作用下的细胞壁含量变化，发现在一定的抗生素JX浓度范围内，嗜根考克氏菌细胞壁的含量随抗生素JX作用浓度增加而呈现上升趋势，当抗生素JX浓度达到MIC时，嗜根考克氏菌细胞壁含量比对照组细胞壁增加了76.5% (图2)。

图2 抗生素JX对嗜根考克氏菌细胞壁合成的影响 Figure 2 Effect of the antibiotics on cell wall synthesis of K. rhizophila

1.3菌体蛋白的提取与鉴定

本研究使用iTRAQ技术进行蛋白质相对定量，所用质谱仪器是Triple TOF 5600。在本次实验中共得到327 366张谱图，采用Mascot软件进行分析，匹配到77 809张谱图，其中70 346张是Unique谱图，鉴定到的蛋白计1 780个，13 420个肽段，其中含有12 178个Unique肽段。

1.4差异表达蛋白的筛选

用iTRAQ技术对蛋白进行相对定量时，当某一蛋白质的丰度差异倍数大于1.2倍、同时假设检验(p≤0.05)，则定义该蛋白是不同样品间的差异蛋白。而当某一蛋白质的量在两样品间无显著变化，那么该蛋白质丰度接近于1。本研究对上述鉴定到的1 780个蛋白的差异倍数以2为底取对数，然后做出分布图(图3)，居于横坐标0右侧为表达量上调的蛋白，居于横坐标0的左侧为表达量下调的蛋白。设定差异表达蛋白的筛选条件为在2次重复中至少有1次重复满足差异倍数(≥1.2或者≤0.833)和统计显著性(p≤0.05)，并且在剩余的重复中表达趋势保持一致，得到差异表达蛋白质共149个(P≤0.05)，其中，表达上调蛋白106个(上调倍数≥1.20, P≤0.05),表达下调蛋白43个(上调倍数≤0.833，P≤0.05)。

图3 嗜根考克氏菌蛋白质丰度分布 Figure 3 Distribution of protein abundance in K. rhizophila

1.5差异表达蛋白的GO功能显著性富集分析

差异表达蛋白的GO功能显著性富集分析给出差异表达蛋白与哪些生物学功能显著相关。在筛选到的149个差异蛋白中，9个显著性富集为细胞组件(Cellular component)，66个显著性富集为分子功能(Molecular function)，47个显著性富集为生物学途径(Biological process) (表1)。根据GO功能显著性富集分析可知，发现一个与细菌细胞壁肽聚糖合成相关的上调蛋白MurG (Accession：gi|752628268|ref|WP_041297629.1|)，其上调倍数为1.224。

表1 差异蛋白的GO功能显著性富集分析 Table 1 Significant enrichment analysis of Go function of differential proteins

1.6差异表达蛋白的RT-PCR验证

选择16S rRNA为内参基因，采用RT-PCR技术分析了抗生素JX作用下嗜根考克氏菌细胞壁肽聚糖合成相关的MurG蛋白mRNA表达水平。在抗生素JX作用下，嗜根考克氏菌MurG的mRNA相对表达含量为16.56，大于1。

2讨论

核苷类抗生素根据其结构的不同，可以分为碱基类似物、简单核苷类、酰基核苷类、糖基核苷类、核苷酸类等，其中糖基核苷类抗生素、结构复杂的酰基核苷类通常影响细胞壁多糖、蛋白质等各种生物大分子的合成，或者影响细胞的分裂，而结构简单核苷类抗生素、简单的碱基类似物可能影响核酸的合成(Sino, 1988; Rachakonda and Cartee, 2004; Winn et al., 2010; Isono, 1991)。本研究研究的炭样小单孢菌JXNU-1所产抗生素JX经初步分析为一核苷类抗生素，从抗生素JX作用下的嗜根考克氏菌细胞形态来看(图1)，抗生素JX抑制了嗜根考克氏菌的细胞分裂；与此同时，实验发现，抗生素JX作用下的嗜根考克氏菌细胞的细胞壁含量升高，应该说这是一个值得进一步研究的发现。

iTRAQ技术与传统双向凝胶电泳相比，具有分辨率高、重复性好的优点，它可以鉴定任何类型的蛋白质，并且可同时定量多达8个样品。本研究采用iTRAQ技术对抗生素胁迫下嗜根考克氏菌的蛋白质组进行分析，从蛋白质组学角度揭示炭样小单孢菌JXNU-1所产核苷类抗生素JX对嗜根考克氏菌细胞壁合成影响。在抗生素JX作用下，嗜根考克氏菌细胞中有149个蛋白发生差异表达，其中106个表达上调，43个表达下调蛋白。在上调蛋白中发现一个和细菌细胞壁肽聚糖合成相关的蛋白MurG(Accession:gi|752628268|ref|WP_041297629.1|)，其上调倍数为1.224，这一结果通过实时荧光定量PCR得到印证。

细菌细胞壁主要成分是肽聚糖，它能够保护细菌免受外来物质侵扰(Koch, 2003)，同时是很多药物的靶标。肽聚糖的生物合成过程，根据其在细菌中的功能区域不同，可分为三个阶段(Silver, 2006)，第一个阶段在细胞质中进行，合成UDP-NAMA-五肽；第二阶段在细胞膜上进行，包括NAG与NAMA-五肽结合形成肽聚糖单体以及类脂载体的再生；第三阶段在细胞壁上进行,肽聚糖链通过肽链间的连结发生交联(武大雷和沈旭, 2008)。本研究采用iTRAQ技术分析获得一个参与细胞壁肽聚糖合成的差异表达蛋白MurG，该蛋白被鉴定为上调蛋白。在炭样小单孢菌JXNU-1所产核苷类抗生素JX作用下，细胞壁肽聚糖合成相关基因murG大量表达，从而导致肽聚糖大量生物合成，细胞壁含量增加。另外有文献报道，MurG与细胞分裂有关，对细胞形态也有影响(Tamimount et al., 2007; Gupta et al., 2015)。但有关炭样小单孢菌JXNU-1所产核苷类抗生素JX如何促进MurG表达，及相互作用的分子机制还不清楚。

总结以上，可以认为，炭样小单孢菌JXNU-1产抗生素JX通过抑制嗜根考克氏的细胞分裂而抑制细菌的生长，同时，嗜根考克氏菌在抗生素JX的作用下通过促进细胞壁的合成以阻止抗生素JX进入细胞，达到保护自身细胞的作用。当然，这一现象是否具有普遍性，以及嗜根考克氏菌在抗生素JX的作用下如何促进MurG的表达，进而促进细胞肽聚糖的合成还有待于进一步研究。

3材料和方法

3.1菌株

炭样小单孢菌JXNU-1(M. carbonacea JXNU-1)由江西师范大学生命科学学院提供；嗜根考克氏菌(K. rhizophila)由江西师范大学生命科学学院提供。

3.2培养基和主要试剂

NB肉汤培养基购自杭州微生物试剂有限公司，高氏Ⅰ号培养基制备参见文献(李瑾等, 2013)，种子培养基和发酵培养基制备参见文献(李瑾等, 2013)。iTRAQ8标记试剂盒与Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)购自ABI公司；胰蛋白酶(Trypsin)购自sigma公司；2-D Quant Kit购自GE Healthcare公司。

3.3炭样小单孢菌的发酵培养与抗生素溶液的制备

参照文献(龙中儿等, 2008b)的方法进行：将发酵液4 000 r/min离心20 min，去沉淀，上清用新华滤纸过滤，用量筒量取滤液后，加入两倍体积的无水乙醇，在4℃冰箱沉淀4 h，然后4 000 r/min离心15 min，把上清pH调成7.0，用旋转蒸发仪除去酒精，加蒸馏水恢复原发酵液的体积，测浓度为117.5 ug/mL，用针孔式过滤器过滤除菌，并验证过滤除菌的方法有效，4℃冰箱保存备用。

3.4抗生素对嗜根考克氏菌及其细胞壁合成的影响

测定抗生素JX对细菌细胞壁含量的影响(彭伟梦, 2010)：配制含不同浓度抗生素JX的NB培养基50 mL，接入嗜根考克氏菌菌悬液，使嗜根考克氏菌的终浓度为105 cfu/mL，200 r/min、37℃振荡培养12 h，显微观察抗生素JX作用下的嗜根考克氏菌体形态，发酵液4 000 r/min 离心20 min，倒掉上清，离心管壁上残留的水分用吸水纸吸干，称取相同质量的湿菌体，并向管中加入相同体积的蒸馏水，重悬后，超声破壁(间歇5 s,工作3 s,共20 min)，4 000 r/min离心20 min，收集上清液，10 000 ×g离心20 min，倒掉上清，收集沉淀即细胞壁碎片，比较抗生素作用下细菌细胞壁含量的变化。每试验重复三次，取其平均值。

3.5抗生素对嗜根考克氏菌蛋白质表达的影响

3.5.1样品的处理

配制含不同浓度抗生素JX的NB肉汤培养基50 mL，设不加抗生素JX的NB肉汤培养基为对照组，分别接入嗜根考克氏菌菌悬液，使嗜根考克氏菌的终浓度为105 cfu/mL，200 r/min、37 °C培养12 h。将培养物置于4 000 r/min离心20 min，弃上清，PBS洗涤3次，收集菌体样品。

3.5.2蛋白质的提取

蛋白质的提取(马良宏等, 2015)：分别称取相同质量的菌体样品，然后用蛋白裂解液溶解，之后分别加入终浓度为2 mm的EDTA，1 mm的PMSF，5 min后，加DTT至终浓度为10 mm，超声破碎15 min后，25 000 g下离心20 min，取上清液，然后加5倍体积预冷过的丙酮，于-20℃静置2 h，再用16 000 g离心20 min，倒掉上清液，收集沉淀，添加一定量的蛋白裂解液溶解，之后分别加入终浓度为2 mm的EDTA，1 mm的PMSF，5 min后，加DTT至终浓度为10 mm，超声破碎15 min后，25 000 g下离心20 min，取上清液，添加DTT至终浓度为10 mm，56℃处理1 h，还原二硫键，然后加入IAM至终浓度为55 mm，暗室静置45 min，加适量预冷过的丙酮，-20℃沉淀2 h，25 000 ×g离心20 min，倒掉上清液，加入200 μL 0.5 M TEAB，超声溶解15 min，25 000 ×g离心20 min，取上清，-80℃保存备用。Bradford 定量并用12% SDS-PAGE检测总蛋白提取质量。

3.5.3嗜根考克氏菌的差异蛋白组学分析

蛋白质iTRAQ标记(马良宏等, 2015)：取100 μg蛋白质样品，加入适量胰蛋白酶(蛋白：酶=20:1)，37℃条件下酶解4 h，照上面的比例再加一次胰蛋白酶，37℃条件下酶解8 h，利用真空离心泵抽干肽段，用0.5 M TEAB再次溶解肽段，然后开始iTRAQ标记，不同组肽段用不同的iTRAQ标签来标记，在室温条件下培养2 h，把标记过的各组肽段混匀，通过SCX柱完成液相分离，最后进行Nano LC-MS/MS分析。质谱数据经Data Analysis 4.0软件自动分析标峰得到mgf文件，利用Mascot2.3.02软件搜索数据库K. rhizophila-NCBI (6 362 sequen- ces)进行蛋白质鉴定，肽段匹配误差控制在0.05 Da以下。然后，利用iTRAQ定量的ratio值(抗生素处理组与对照组表达量比值的四个ratio值的平均值)和单样本t检验的P值，选出差异表达蛋白，其中差异蛋白筛选条件为：在2次重复中至少有1次重复中满足差异倍数(≥1.2或者≤0.833)和统计显著性(p≤0.05)，并且在剩余的重复中表达趋势保持一致。最后，利用Blast2GO程序对分析得到蛋白分别进行GO(基因本体论)、COG(直系同源簇)、KEGG(京都基因与基因百科全书)注释，得到蛋白的功能信息。

3.6差异表达蛋白RT-PCR分析

按照上述方法收集菌体，采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌总RNA提取试剂盒(DP430)提取总RNA。取2 ug总RNA进行反转录，反转录方法参照TaKaRa双链反转录试剂盒说明书。RT-PCR检测参照文献(黄雨薇等, 2015)：荧光定量所用的内参基因为16S rRNA，利用Primer 5.0设计引物(表2)；反应体系为20 μL：PowerUpTM SYBR Green Master Mix (2×) 10 μL，上下游引物各1.2 μL，cDNA 40 ng，最后添加灭菌水至20 μL，设3个重复样品；实时定量检测采用StepOneTM and StepOnePlusTM 荧光定量PCR仪(ABI，USA)进行，反应条件为：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，共40个循环；融解曲线测定为从60℃到95℃，定量数据采用△△Ct方法计算得出，相对定量的结果为2－△△Ct。当定量结果2－△△Ct>1时，即表示为蛋白mRNA的上调倍数；当定量结果2－△△Ct<1时，即表示为蛋白mRNA的下调倍数；当定量结果2－△△Ct=1时，即表示为蛋白mRNA表达量无变化。

表2 实时荧光定量 PCR的引物序列 Table 2 Sequences of qRT-PCR primers

3.7分析方法

抗生素的最低抑菌浓度采用试管二倍稀释法测定，具体方法见参考文献(Sanders and Sanders, 1974; 曲径等, 2015)；细菌细胞壁含量采用湿量法测定，具体方法见参考文献(彭伟梦, 2010)；蛋白质含量采用Bradford法测定，具体方法见参考文献(Bradford, 1976)。

作者贡献

陈鹏是本研究实验工作的具体执行人，完成数据分析和论文初稿的写作；黄运红和李非负责文献查阅、实验辅助；李素珍负责部分实验操作；龙中儿是项目的构思者及负责人，指导实验设计，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目(31160029; 31360018)和江西省自然科学基金项目(20132BAB- 204007)共同资助。

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