高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)为禾本科羊茅属植物，多年生草本，丛生型，须根发达，适应性广，并具有耐寒、耐践踏、抗病性强、竞争力强等特征，是一种重要的牧草和草坪兼用型草种，在国内外农牧业和草坪业中占据重要的地位(黄新等, 2008)。获取高质量的RNA是进行高羊茅分子生物学研究的必要前提和关键技术，如目的基因的克隆、cDNA文库的构建、RT-PCR分析、印迹杂交分析等都需要高质量的RNA(赵军胜, 2007)。尽管RNA的提取已经成为很成熟的技术，但在实际研究中经常很难做到顺利获得高质量的RNA(何庆元等, 2009)。对许多植物而言，由于缺乏有效的高质量RNA提取方法，使其分子生物学研究受到限制(Bahloul and Burkard, 1993)。由于植物体内含有多种次生代谢产物以及蛋白质和多糖等大分子物质，影响RNA的提取效率，干扰之后的逆转录、酶切等试验，此外不同植物的代谢产物差异非常显著，加之植物组织本身的特异性，所以很难有一种方法适合于所有植物总RNA的提取(Ainsworth, 1994)。

目前，国内关于植物组织总RNA提取方法的报道很多，绝大多数常规的植物组织总RNA提取方法均存在有比较费时的缺点(李聪等, 2008)。由于RNA易降解，所以在操作过程中时间越短，降解的可能性才会越小。Trizol试剂盒是一个省时的方法，但价钱较为昂贵。异硫氰酸胍法是利用异硫氰酸胍、β-巯基乙醇、十二烷基肌氨酸钠等使RNase变性，并使RNA在酸性条件下游离进入水相，而变性的RNase和其他的蛋白连同基因组DNA进入有机相。经反复的酚氯仿抽提后的水相用异丙醇沉淀可得高质量的RNA。其优点在于步骤简单，省时快速，能同时处理多个样品(Gasic et al., 2004)。我们通过对常用的异硫氰酸胍法进行改进，旨在建立一种简单快速并适于高羊茅总RNA的提取方法，为进行后续的分子生物学研究奠定基础。

1结果与分析
1.1不同方法提取高羊茅总RNA完整性检测
琼脂糖凝胶电泳检测结果显示Trizol法能够从成熟的高羊茅叶片中提取出总RNA，28S rRNA与18S rRNA条带亮度接近于2:1，说明RNA未被降解(见图1A)。Trizol法虽然有快速高效的特点，但其价格昂贵，不适用于大量植物组织提取。

异硫氰酸胍法提取高羊茅总RNA的电泳检测显示(图1B)：28S rRNA与18S rRNA条带均有拖尾现象，5S rRNA条带较亮，说明总RNA有部分降解，且存在DNA污染。同时点样孔有亮带，说明蛋白质污染严重。

实验对异硫氰酸胍法进行改进后，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示(图1C)，点样孔中没有亮带，证明没有蛋白质的污染，图中28S rRNA和18S rRNA两条带非常清晰，并且这两条带的亮度接近2:1，同时5S rRNA条带很弱，证明总RNA中没有DNA污染，且纯度高、完整性好，没有明显的降解。

图1 不同方法提取高羊茅叶片总RNA的检测结果 注: A: Trizol法; B: 异硫氰酸胍法; C: 改良的异硫氰酸胍法 Figure 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA by different methods Note: A: Trizol method, B: Isothiocyanate method, C: Improved isothiocyanate method

1.2不同方法提取高羊茅总RNA纯度及浓度检测
吸光度比值大小直接反映多糖、多酚和蛋白质的污染程度。由表1可知，采用改良后的异硫氰酸胍法和Trizol法提取的总RNA其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8~2.0之间，表明RNA完整性很好，可以用于
进一步的分子生物学研究，OD₂₆₀/OD₂₃₀比值在2.0~2.5之间，表明这2种方法得到的RNA纯度高；异硫氰酸胍法提取的RNA样品OD₂₆₀/OD₂₈₀比值较小，说明有蛋白或苯酚存在，其OD₂₆₀/OD₂₃₀比值小于2.0，表明其中有大量的小分子或盐存在，所得的RNA有待进一步纯化。

表1  高羊茅总RNA纯度及浓度分析 Table 1 The quality of RNA sample by different extraction methods

1.3高羊茅总RNA的cDNA-AFLP分析
cDNA-AFLP实验最为关键的步骤是获得高质量的cDNA模板并对其进行充分彻底酶切，而提取高质量的总RNA是合成高质量cDNA模板的前提。为了进一步验证改良的异硫氰酸胍法所提的总RNA质量，通过合成cDNA双链然后进行cDNA-AFLP分析，结果表明异硫氰酸胍法经过改良后所提取的总RNA质量高、无污染，经反转录、酶切后可获得清晰的AFLP图谱(见图2)，完全可用于后续的cDNA-AFLP分析。

图2  改良的异硫氰酸胍法提取高羊茅叶片总RNA的cDNA-AFLP分析 Figure 2 cDNA-AFLP analysis of total RNA by modified AGPC protocol

2讨论
高质量的RNA是进行基因克隆、基因表达研究等的前提。目前常见的提取方法有异硫氢酸胍法、CTAB法、热硼酸法、苯酚法、阴离子去污剂法、LiCl-尿素法、TRIZOL试剂快速提取法、Gomez法、CsCl超离提取法等多种，但由于植物种类的不同以及同一植物的不同部位都有其各自的生理结构特点，且所含的内源物质存在差异，因此需要根据各种方法自身的特点，对其进行筛选和改进，才能获得适合于不同植物RNA提取的最佳方法(印华等, 2009)。此外，由于RNA极易被微量的RNase所降解，同时植物组织中含有大量的次级代谢产物，对总RNA的提取干扰很大，这样使得植物组织总RNA的提取相对较难(李晓颖等, 2010; Lewinsohn et al., 1994)。Trizol法因其操作简单快捷的优点，是目前提取RNA常用的首选方法之一，实验表明Trizol法最简单，也最省时间，仅需要2 h左右，并且获得的高羊茅总RNA完整性和纯度都较好。但是其费用相对较高，不适合大量植物组织RNA的提取。异硫氰酸胍法是目前实验室提取植物总RNA常用的方法之一，其主要是利用异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠与巯基乙醇共同作用使蛋白质变性，从而抑制RNase活性，同时在酸性条件下DNA可与蛋白质一起变性被离心下来，RNA则被分离，溶于上清液中。其成本较为低廉，时间上需要3~4 h，但是所获得的高羊茅总RNA的质量较差，RNA有一定的降解，且有蛋白质污染。RNA的降解可能是由于研磨时间较长，RNase活性未被抑制，导致内源RNase释放降解RNA。此外由于植物材料研磨不充分，造成多糖及蛋白质沉淀不完全，影响总RNA的纯度(贾永红等, 2008; 赵锦等, 2009)。

实验通过对异硫氰酸胍法进行一些细节的改良，在研磨后先加入变性液与巯基乙醇，通过进一步研磨然后再进行分装，由于液氮的冰冻作用，可以减少巯基乙醇的挥发。在液氮冻融过程中，变性液与巯基乙醇可以更好的发挥对RNase活性的抑制作用，继续研磨更有利于其与植物细胞的混匀，提高RNA的提取效率。此外加大巯基乙醇的量，可以在短时间内更好的抑制RNA酶的活性，减少其对RNA的降解，从而得到了高质量的总RNA。特别是在大量提取总RNA时，改良的异硫氰酸胍法更能突显它的优势，缩短实验时间，减少RNase污染机会。利用该体系获得的高羊茅RNA，不但纯度高、完整性好，完全可以满足进一步分子生物学实验的要求，为高羊茅分子标记辅助育种、基因定位与克隆、高密度基因图谱的绘制和基因功能的研究奠定了一定基础，同时也可为其他禾本科草坪草总RNA的提取提供借鉴和参考。

3材料与方法
3.1材料
以田间栽培的高羊茅为材料，采集幼嫩叶片，经液氮处理后，迅速放置于-80℃超低温冰箱保存备用。

3.2无RNase环境的创建
RNA提取必须创造无NRase的环境，所有离心枪头都要用0.1%~0.2%的DEPC溶液处理，37℃保温12h以上，然后高压灭菌，灭活DEPC；研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等需在160℃干烘8 h以上；溶液都需用经DEPC处理过的水配制；电泳槽、胶板及梳子等也用DEPC处理过夜或是用洗涤灵清洗干净后用0.5%的SDS (Sodium dodecyl sulfate, 抑制RNase的活性)浸泡过夜，然后用ddH₂O冲洗干净晾干备用(尹慧等, 2008; Malnoy et al., 2001)。
利用细叶桉(P₂) DNA进行EST-SSR引物的PCR条件优化，主要针对PCR体系的Mg²⁺浓度和PCR程序的退火温度。PCR优化后，选择PCR产物长度不同的32个EST-SSR进行测序实验，引物序列和PCR产物大小见表1。PCR体系和PCR程序参考张晓红等(2009)，退火温度均为56℃，但10Buffer中Mg²⁺浓度改为15或20 mmol/L。

3.3 RNA的提取
异硫氰酸胍法：参照Chomczynski and Sacchi (1987)和Chao等(2009)的方法进行总RNA的提取。

Trizol法：Trizol试剂购于上海生工生物工程有限公司，参照试剂盒说明书进行总RNA的提取。

改良的异硫氰酸胍法：在传统方法中，植物材料经过研磨分装后再加入变性液与β-巯基乙醇，现在改为研磨后，先加入变性液与β-巯基乙醇，待完全融化，研磨均匀后再进行分装；同时加大β-巯基乙醇的用量，由原来的3.0 μL变为5.0 μL。

3.4总RNA检测及纯度分析
1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，用BioRad凝胶成像系统拍照记录。

取5 μL总RNA溶液，加0.1%DEPC水至500 μL，在紫外分光光度计上扫描，测定230 nm、260 nm和280 nm波长下的光密度值(D)，并用D₂₆₀/D₂₈₀及D₂₆₀/D₂₃₀的比值计算纯度。

RNA产率(μg/g)=OD₂₆₀×N (样品稀释倍数)×40 (μg/mL)×V(体积)/样品重(g)(赵锦等, 2009)

3.5 cDNA-AFLP分析
取2 μg所提取的高羊茅总RNA，采用TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit试剂盒合成双链cDNA，纯化后稀释20~50倍，之后用EcoR I和Mse I酶切，然后进行人工接头连接作为预扩增的模板。预扩增产物稀释20倍后用于选择性扩增，扩增产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染检测(王天奎等, 2009)。

作者贡献
王康、李恩杰是本研究的实验设计和实验研究的执行人；王康、李恩杰完成数据分析，论文初稿的写作；董洁参与实验设计，试验结果分析；周禾是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究得到国家重点基础研究发展计划(973项目)课题(2007CB108902)资助。

参考文献
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