木质素(Lignin)是由三种醇单体或单木质酚如香豆醇、松柏醇和芥子醇等合成的一种复杂的酚类聚合物，是木质部细胞次生细胞壁的主要成分之一。在细胞壁木质化过程中，木质素逐步渗入到细胞壁，填充于纤维素构架内，加大了细胞壁的硬度，增强了细胞的机械支持力和抗压强度，促进机械组织的形成，有利于巩固和支持植物体及促进水分、溶质输导等。同时，由于木质素的不可溶性及多酚类物质的化学特性，也增强了植物的抗病能力(陈永忠等, 2003; Boerjan et al., 2003)。已有研究揭示，木质素的生物合成大致可分为3个步骤：首先是植物光合作用后的同化产物到苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸的合成过程；其后是从苯丙氨酸到羟基肉桂酸(HCA)及其辅酶A酯类；最后是从羟基肉桂酰辅酶A酯类到合成木质素单体及其聚合物的过程(陈永忠等, 2003; Boerjan et al., 2003)。在木质素合成的过程中有很多的酶参与作用，其中肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)和肉桂醇脱氢酶(CAD)催化了第三阶段木质素单体的合成途径。

植物MYB转录因子家族成员众多，它们在结构上的特点是具有保守的DNA结合结构域，已有研究揭示它们主要在细胞周期和次生代谢中发挥调控作用(Stracke et al., 2001)。桉树(Eucalyptus gunnii)中的研究发现，MYB转录因子EgMYB2与EgCCR和EgCAD2启动子的顺式调控区结合，正向调控了EgCCR和EgCAD2在微管组织和木质化过程木质部中的特异表达(Lacombe et al., 2000; Lauvergeat et al., 2002; Goicoechea et al., 2005)。EgMYB2及其松树同源基因PtMYB4过量表达的转基因烟草与野生型相比，均表现出次生细胞壁明显增厚，木质素含量显著增加；与木质素合成相关酶类的表达丰度也明显提高(Patzlaff et al., 2003; Goicoechea et al., 2005)。拟南芥EgMYB2同源基因AtMYB61的表达变异引起了突变体det3的木质化异位(Newman et al., 2004)，AtMYB46、AtMYB83的过量表达激活了纤维素、木聚糖和木质素的生物合成路径，并引起非厚壁组织细胞次生细胞壁的异常加厚(Zhong et al., 2007; McCarthy et al., 2009)。这些研究结果表明，EgMYB2及其在不同物种中的同源基因均有调控木质素合成功能。定位于遗传图普中的EgMYB2还与控制桉树木质部木质素含量性状位点表现出共分离，这表明，很可能是EgMYB2的等位变异引起了不同基因型桉树材料间木质部木质素含量的变化(Goicoechea et al., 2005)。

在梨果实发育过程中，果皮角质层和表皮细胞破损后积累的木栓层形成果皮褐色锈斑(滕元文等, 2005, 中国南方果树, 34(3): 52-54, 56)，木质素是木栓层的重要成分(Pereira, 1988; Lopes et al., 2001)，因此木质素的积累可能与梨果皮锈斑的形成有关。此外，木质素是细胞壁次生结构和石细胞的主要成分，石细胞是由细胞壁次生加厚、木质素沉积而形成的，木质素的合成、转运和沉积与石细胞的发育关系密切(乔勇进等, 2005)。因此在砂梨中开展木质素合成调控的分子机理研究对分析砂梨相关品质形成的机理具有非常重要的意义。

苹果和梨同为蔷薇科梨亚科，以前的研究揭示，苹果和梨基因组间存在高度的微观共线性(Yamamoto et al., 2004; Velasco et al., 2010)，苹果中有关基因家族组成及序列信息可作为梨中同源基因分析的重要参考。基因启动子在基因表达调控中发挥着重要作用。本研究以苹果基因组序列信息为桥梁，克隆了4个砂梨的EgMYB2同源基因启动子序列，预测并分析了所获启动子的调控元件组成及类型，以及各启动子在绿皮与褐皮果砂梨材料中的等位变异情况。

1结果与分析
1.1苹果EgMYB2同源基因的搜索
以EgMYB2为探针序列，通过BlastP搜索苹果蛋白数据库，共获得4条同源序列，分别为MDP0000736994、MDP0000296109、MDP0000722954和MDP0000204495，依次位于苹果的第2、第7、第3和第2染色体，我们将其对应的基因分别命名为MdMYBx1、MdMYBx2、MdMYBx3和MdMYBx4。

序列分析发现，这4个基因与EgMYB2间分别存在76.1%、75.3%、69.9%和69.9%的蛋白质序列同源性；系统发生分析显示，MdMYBx1、MdMYBx2与EgMYB2聚为一组，而MdMYBx3和MdMYBx4与拟南芥的AtMYB46聚为一组，由此可以推测，苹果基因组中的两组EgMYB2同源基因(图1)在苹果与桉树及拟南芥发生分化前已经存在，在苹果与桉树及拟南芥发生分化后，这两组EgMYB2同源基因各发生了一次基因复制；苹果的4个EgMYB2同源基因与AtMYB61、PtMYB4间均存在较大的序列分化。

1.2砂梨EgMYB2同源基因启动子序列的克隆
我们分别选取苹果MdMYBx1、MdMYBx2、MdMYBx3和MdMYBx4起始密码子上游1 000 bp序列进行分析，根据预测的启动子位置，在启动子上游保守区段设计了2个正向引物(MYBx1/x2: 5'CCAGTAGTACTTGGGGTTGTAGA3'; MYBx3/x4: 5'GATTGTGAAAGCTCCAAATCAC3')，它们各自与位于启动子下游保守性反向引物(5'CATCTTCCTCTGGTGACCACAA3')组合，分别用于扩增砂梨品种初夏绿基因组中MdMYBx1/MdMYBx2，MdMYBx3/MdMYBx4同源基因的启动子序列。

图1 苹果基因组中EgMyb2同源基因的系统发生分析 注: MdMYBx1, MdMYBx2, MdMYBx3和MdMYBx4分别代表苹果基因组中4个不同的EgMyb2同源基因; 它们对应蔷薇科基因组数据库(GDR, Genome Database for Rosaceae)序列编号分别为MDP0000736994, MDP0000296109, MDP0000722954和MDP0000204495 Figure 1 Phylogenesis of EgMyb2 homologues in apple genome Note: MdMYBx1, MdMYBx2, MdMYBx3 and MdMYBx4 represent the four different EgMyb2 homologues in apple genome; Their accessions in the GDR (Genome Database for Rosaceae) are MDP0000736994, MDP0000296109, MDP0000722954 and MDP0000204495, respectively

扩增产物克隆测序后获得长度分别为821 bp、874 bp、972 bp和914 bp的4条序列。序列比较发现，这4条砂梨序列分别与苹果MdMYBx1、MdMYBx2、MdMYBx3和MdMYBx4启动子序列间存在94.6%，95.6%，97.6%和96.1%的同源性，这4条序列已提交GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，其序列号分别为JF900710、JF900709、JF900707和JF900708，我们将这4条启动子序列对应的砂梨基因分别命名为PpMYBx1、PpMYBx2、PpMYBx3和PpMYBx4。

对苹果和砂梨的启动子序列进行系统发生分析发现，这8条序列共分化成2组，每组又分化成2个亚组，每个亚组均包含1个苹果序列和1个砂梨序列(图2)，据此可以推测MYB1与MYB2，MYB3与MYB4间的复制在苹果与梨物种分化前已经发生。

图2梨与苹果EgMyb2同源基因启动子序列的系统发生 注: 启动子: MdMYBx1, PpMYBx1, MdMYBx2, PpMYBx2, MdMYBx3, PpMYBx3, MdMYBx4, PpMYBx4 Figure 2 Phylogenesis of the promoters of pear and apple EgMyb2 homologues Note: Promoter: MdMYBx1, PpMYBx1, MdMYBx2, PpMYBx2, MdMYBx3, PpMYBx3, MdMYBx4, PpMYBx4

1.3砂梨EgMYB2同源基因启动子预测
对所克隆的4条砂梨序列的启动子预测结果显示，各序列中均存在启动子、增强子和TATA-box特征序列，其中PpMYBx3的启动子序列中预测存在2个TATA-box和2个启动子特征序列(表1)。 

表1 砂梨木质素合成相关转录因子基因MYB启动子区特征序列位置预测 Table 1 Predicted position of the characteristic sequence in the promoter regions of sand pear putative transcription factor gene MYB related to lignin biosynthesis

各启动子序列中存在着丰富的调控元件，按照调控元件的功能将其分为6种类型(表2)，这些调控元件反映了基因的表达特征。在各类调控元件中，以组织特异性元件数目最多，主要为涉及根部、胚轴和种子中表达的调控元件；其次是胁迫激素和生长激素应答类元件，胁迫激素应答元件主要为ABA应答元件，少数为SA应答元件；生长激素应答类元件包括了GA应答型和IAA应答型两类。“其它”类型主要为基因表达的基础调控元件。尽管各启动子调控元件的组成类型相似，但在某些类型调控元件的数目上存在明显差异。与其它基因的启动子序列相比，PpMYB1启动子序列中生物胁迫和生长激素应答类元件的数目明显偏多，PpMYBx2和PpMYBx3启动子序列中胁迫激素应答类元件的数目也明显偏多。这一现象表明，4个砂梨EgMYB2同源基因可能存在表达上的分化。 

表2砂梨木质素合成相关转录因子基因MYB启动子调控元件类型及数目 Table 2 Type and number of regulatory elements in the promoters of sand pear putative transcription factor gene MYB related to lignin biosynthesis

1.4褐果皮与绿果皮砂梨中EgMYB2同源基因启动子的等位变异分析
为分析砂梨EgMYB2同源基因启动子序列中是否存在与果皮褐色相关的等位变异，首先分别选取3个褐果皮和3个绿果皮材料，以其基因组DNA为模板，克隆各材料中EgMYBx2同源基因的启动子序列，测序后分别分析各个基因启动子序列在褐果皮与绿果皮材料间的等位变异。结果发现，PpMYB2启动子区在褐果皮与绿果皮砂梨材料间存在一个与皮色分化相一致的单核苷酸位点变异，该位点在所有褐皮梨的克隆中均为鸟嘌呤G，而在所有绿皮梨的克隆中均为腺嘌呤A(图3)。

图3 PpMYBx2启动子区在褐果皮与绿果皮砂梨材料间存在的等位变异 注: MYB5’2-1-1, MYB5’2-1-8, MYB5’2-1-9, MYB5’2-2-1, MYB5’2-2-8, MYB5’2-3-3和MYB5’2-3-6表示来自不同果褐皮材料的克隆编号; MYB5’2-4-3, MYB5’2-4-4, MYB5’2-5-1, MYB5’2-5-4和MYB5’2-6-6表示来自不同绿果皮材料的克隆编号; *: 等位变异处 Figure 3 Allelic variation exists in PpMYBx2 promoter region between the green- and russet-skin-fruit sand pear genotypes Note: MYB5'2-1-1, MYB5'2-1-8, MYB5'2-1-9, MYB5'2-2-1, MYB5'2-2-8, MYB5'2-3-3 and MYB5' 2-3-6 indicate numbers of the clones from different russet-skin-fruit sand pear genotypes; MYB5'2-4-3, MYB5'2-4-4, MYB5'2-5-1, MYB5'2-5-4 and MYB5'2-6-6 indicate numbers of the clones from different green-skin-fruit sand pear genotypes; *: Allelic variation

为进一步分析该SNP位点与砂梨果皮褐色/绿色的相关性，我们在该位点处设计了一正向SNP引物PP0180 (5'TAAGGATAAATTGTCCACACGCAA3')，该引物与反向引物(5'CATCTTCCTCTGGTGACCACAA3')组合，可以区分该SNP位点处的等位变异。如图3所示，该SNP引物组合可对SNP位点处含有腺嘌呤A的序列进行高效扩增(图4, 4泳道, 5泳道, 6泳道)，而对SNP位点处含有鸟嘌呤G序列的扩增效率很低(图4, 1泳道, 2泳道, 3泳道)。

用所设计的引物分别扩增8个绿皮果和8个褐皮果材料的基因组DNA(图5)，结果显示：绿皮果材料中有7个扩出明亮的目标条带；褐皮果材料中尽管有5个材料的扩增带较弱，但有3个材料也扩增出明亮的目标条带。

图4 SNP引物在PpMYBx2启动子区等位变异处扩增产物电泳 注: M: 分子量标记; 1、2、3分别表示来自不同褐皮砂梨材料的PpMYBx2启动子区克隆MYB5’2-1-1, MYB5’2-2-1和MYB5’2-3-6; 4、5、6分别表示来自不同绿皮砂梨材料的PpMYB2启动子区克隆MYB5’2-4-3, MYB5’2-5-1和MYB5’2-6-6 Figure 4 Gel electrophoresis of PCR products amplified by the SNP primers located at the allelic variation position in the PpMYBx2 promoter region Note: M: Molecular weight marker; 1, 2 and 3 represent PpMYB2 promoter clones MYB5'2-1-1, MYB5'2-2-1 and MYB5'2-3-6 from different russet-skin-fruit sand pear genotypes, respectively; 4, 5 and 6 represent PpMYBx2 promoter clones MYB5’2-4-3, MYB5’2-5-1 and MYB5’2-6-6 from different green-skin-fruit sand pear genotypes, respectively

 

图5 PpMYBx2启动子区SNP引物在不同绿皮与褐皮砂梨材料中扩增产物的电泳检测 注: M: 分子量标记; 1~8: 绿果皮梨材料19-59, 19-67, 21-65, 20-62, 20-71, 19-52, 5-18和‘初夏绿’的基因组DNA模板; 6~10: 褐果皮梨材料‘秋荣’, 19-39, 19-40, ‘清香’, 19-38, 19-42, 19-43, 19-47的基因组DNA模板 Figure 5 Gel electrophoresis of PCR products amplified with the SNP primers located at the PpMYBx2 promoter region in different green- and russet-skin-fruit sand pear genotypes Note: M: Molecular weight marker; 1~8: Corresponding to the genomic DNA templates from the green-skin-fruit sand pear genotypes 19-59, 19-67, 21-65, 20-62, 20-71, 19-52, 5-18 and ‘Chu-xia-lv’, respectively; 9~16: Corresponding to the genomic DNA templates from the russet-skin-fruit sand pear genotypes ‘Akibae’ pear, 19-39, 19-40,‘Qing-xiang’, 19-38, 19-42, 19-43 and 19-47, respectively

2讨论
果皮色泽与果肉石细胞含量是影响砂梨外观和内在品质的重要因素，但尚无关于砂梨果实皮色及石细胞形成分子机理的研究报道。鉴于EgMYB2及其同源基因在木质素生物合成中的重要调控作用，因此选择砂梨的EgMYB2同源基因进行研究，可能对从分子水平探明砂梨果皮褐色及石细胞形成机制具有重要意义。本研究通过对所克隆4个砂梨EgMYB2同源基因启动子序列调控元件的预测分类，预测了砂梨各个EgMYB2同源基因的表达特征。以前的研究发现，松树的PtMYB4基因主要在木质化细胞中表达，桉树的EgMYB2也主要在木质部发生组织中表达，拟南芥的AtMYB46主要在花序干的维管处表达(Patzlaff et al., 2003; Goicoechea et al., 2005; Zhong et al., 2007)，我们在砂梨EgMYB2同源基因启动子序列中预测到了较多调控根部、胚轴中表达的元件，这表明，砂梨EgMYB2同源基因可能与这些组织中的木质素合成调控相关。此外，还预测到多个果实、种子中表达的调控元件，因此砂梨EgMYB2同源基因还可能参与调控了果实、种子部位的木质素合成。启动子序列预测也揭示了砂梨的各个EgMYB2同源基因的调控元件存在分化(表2)。拟南芥中的研究表明，AtMYB46主要在花序干中表达，而AtMYB83则在茎干的维管细胞中特异表达(Zhong et al., 2007; McCarthy et al., 2009)。砂梨各个EgMYB2同源基因间也可能存在类似的表达分化。

褐皮与绿皮砂梨间的启动子序列等位变异分析发现，PpMYBx2启动子区存在1个SNP位点，该位点与砂梨果皮褐色/绿色性状间存在相关性，但与不同材料的褐、绿色果皮变异并不完全符合。已有研究揭示，植物MYB转录因子家族成员众多，它们在结构上的特点是具有保守的单个或多个不完全重复的DNA结合域，这些木质素合成相关的MYB转录因子属于两个重复(R2R3)类型。在拟南芥基因组中共有133个R2R3型MYB转录因子基因，这些基因按序列发生关系被分为24个亚组(Stracke et al., 2001)。木质素合成相关的AtMYB46等被分在第13亚组(Kranz et al., 1998)，该组中除了AtMYB81和AtMYB83，还包含另外6个MYB基因(Allan et al., 2008)，这表明拟南芥中可能存在功能冗余的MYB基因。可以推测，除了本研究已鉴定出4个砂梨EgMYB2同源基因，砂梨基因组中还可能存在多个与拟南芥第13亚组MYB同源的转录因子未被鉴定。对所克隆4个砂梨MYB基因启动子序列的预测分析发现，尽管各启动子序列调控元件存在分化，但组成相似(表2)，因此可以推测：这4个MYB基因可能在砂梨的生长发育过程中具有某些相似的生物学功能，PpMYB2并非是唯一调控砂梨木质素合成的基因。此外，木质素生物合成涉及多个环节以及不同的催化酶类(陈永忠等, 2003; Boerjan et al., 2003)，因此不排除存在MYB以外调控因子变异引起的木质素相关性状遗传差异。

本研究克隆获得了4个砂梨EgMYBx2同源基因的启动子序列，是在园艺植物中克隆到的关于木质素合成代谢关键基因的调控序列。该项研究对于探明砂梨与木质素相关品质性状形成的分子机制和利用基因调控技术进行砂梨品质育种具有重要意义。另外，利用生物信息学对砂梨MYB基因启动子调控元件进行了预测和分析，并进行了启动子序列的等位变异分析，为开展该基因的表达研究和遗传定位，进一步确定其功能奠定了基础。

3材料与方法
3.1材料
于2010年4月在浙江省农业科学院果园(杭州)取绿果皮砂梨材料19-59、19-67、21-65、20-62、20-71、19-52、5-18、‘初夏绿’、5-18、31-3，褐色果皮砂梨材料‘秋荣’、19-39、19-40、‘清香’、19-38、19-42、19-43、19-47、19-49、20-72的幼叶，液氮冷冻后-70℃保存备用。

3.2基因组DNA提取
利用改良的CTAB法(刘小勇等, 1997)提取各砂梨材料的基因组DNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA的纯度和完整性，用U-0080D (Hitachi)紫外分光光度计检测DNA浓度，将检测后的各DNA样品存于-20℃冰箱备用。

3.3同源基因搜索与序列分析
利用桉树EgMYB2基因的蛋白序列(CAE09057)通过BlastP搜索苹果蛋白数据库(http://www.rosaceae.org/projects/apple_genome)，获取苹果对应同源基因的基因组序列，再利用softberry数据库(http://www.softberry.com)对苹果各同源基因的启动子区进行在线预测，砂梨基因启动子序列的预测方法相同。

3.4目标序列的PCR扩增
根据启动子预测结果，在各基因起始密码子上游保守区设计可以扩增完整启动子的引物。引物序列由上海桑尼生物科技有限公司合成。反应体系为：PCR 反应体系25 μL，反应混和物中包括30 ng模板，正、反向引物各5 pmoL，dNTP各5 nmoL，MgCl₂ 37.3 nmoL，rTaq DNA聚合酶 0.5 U (Takara, Japan)，10×酶自带的PCR缓冲液 (2.5 μL)。PCR反应程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s；58℃ 30 s；72℃ 1 min 30 s，35个循环；72℃ 7 min。应用ThermoHybaid梯度PCR仪进行扩增。用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分离。EtBr染色，凝胶成像系统照相。

3.5目的片段的回收、克隆、测序
用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)回收目的片段, 方法参照产品说明。将纯化的目的条带用pGem-T-Easy载体(购自Invitrogen公司)克隆，方法参照厂商说明书。用各基因启动子特异引物通过PCR方法筛选阳性克隆。质粒提取及测序由上海桑尼生物科技有限公司完成。

3.6序列同源性分析、启动子预测及调控元件的注释分类
序列排列和同源分析采用ClustalW方法(Thompson et al., 1994)，参数采用MegAlign (Clewley and Arnold, 1997)软件的默认值。序列启动子及调控元件预测采用softberry网站的植物启动子及调控元件在线预测服务(http://www.softberry.com/
berry.html)。根据预测结果，对调控元件进行功能注释，再按调控元件的类型将其分为组织特异类、生物胁迫应答类、非生物胁迫应答类、胁迫激素应答类、生长类激素应答类及其它共6种类型。

3.7检测启动子区等位变异引物的开发及其在褐皮与绿皮砂梨中的扩增
按照材料与方法3.4与3.5分别克隆3个褐皮和3个绿皮砂梨材料中EgMYB2同源基因的启动子序列，测序后再分析各启动子序列在绿皮材料和褐皮材料间的等位变异，根据分析的结果设计可以检测等位变异的PCR引物，并以不同等位变异序列的克隆为模板，检测所设计引物对启动子等位变异的分辨效果。用检测有效的引物扩增更多的褐皮和绿皮砂梨材料，以分析所获得的等位变异与砂梨褐皮/绿皮性状间的相关性。

作者贡献
王月志是本研究的实验设计和实验研究的执行人；王月志完成数据分析，论文初稿的写作；戴美松参与实验设计，试验结果分析；施泽彬是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究受现代农业(梨)产业技术体系建设专项资金(CARS-29-04)及浙江省农科院博士一次性科研启动经费资助。

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