丽穗凤梨系凤梨科(Bromeliaceae)铁兰亚科(Tillandsioideae)丽穗凤梨属(Vriesea)植物及其杂交种的总称，是观赏凤梨的主要类群之一。其具有花色艳丽、易栽培、花期长和耐荫性强等特点，观赏价值高，有很好的经济开发前景。然而，目前市场上畅销的丽穗凤梨品种大多数是国外育成品种，国内育种研究滞后、自主知识产权品种的缺乏已严重限制了我国丽穗凤梨产业的健康发展，因此，开展丽穗凤梨资源遗传多样性和资源鉴定研究，对其资源保护及新品种培育具有重要意义，而此项研究工作的前提是建立适合丽穗凤梨的分子标记体系。国内外有关丽穗凤梨的研究多集中在生产技术(王炜勇等, 2011)，地理居群(Palma-Silva et al., 2009)等方面，而对丽穗凤梨种质资源的遗传多样性方面的研究在国内外尚未见报道。

ISSR ( Inter-simlpe sequence repeat)是一种简单重复序列扩增多态性分子标记，是由Zietkiewicz等(1994)创建的一种 DNA标记技术，其优点多，不仅DNA样品用量少、实验成本低、操作简单，而且实验多态性高、信息量大、重复性好，目前在品种鉴定、居群遗传学、系统学比较与物种分类以及物种的进化关系等研究中已被广泛应用，并开始在植物遗传多样性研究中运用(周延清等, 2008)。目前已成功用于菊花(缪恒彬等, 2008)、兰花(吴振兴等, 2008)、万寿菊(曾丽等, 2010)等观赏植物的遗传多样性、品种鉴定或指纹图谱构建等研究。李萍等(2007)运用ISSR对光萼荷属凤梨与其近源属亲缘关系进行分析研究，但未见对其反应体系进行优化。虽然ISSR-PCR具有重复性高等优点，但不同反应体系产生的结果也有可能不同(吕岩桢等, 2011)，甚至同一种植物在不同的试验条件下其研究结果都有差异(柴丹丹等, 2008)。同一反应体系在不同的实验条件下，针对不同属的DNA模板对扩增效果的影响较大，因此，对丽穗凤梨ISSR-PCR体系进行优化是必要的。

本研究提取丽穗凤梨种质资源叶片的基因组总DNA，并对ISSR反应体系中主要组分Taq DNA聚合酶浓度、模板DNA 浓度、引物浓度、dNTPs浓度以及Mg²⁺浓度等进行优化，所确立的ISSR反应体系为进一步利用ISSR标记技术开展丽穗凤梨种质资源遗传多样性研究、连锁遗传图谱构建和分子标记育种等方面奠定重要基础。

1 结果与分析
1.1 丽穗凤梨基因组的DNA提取
将用CTAB法提取叶片得到的DNA通过琼脂糖跑胶和分光光度计来测其质量和浓度，结果DNA条带清晰，杂质含量较少，可以满足ISSR的实验要求(图1)。
 

图1 丽穗凤梨23份样品DNA提取 Figure 1 The DNA extracted from 23 samples of Vriesea Bromeliads

1.2 丽穗凤梨ISSR-PCR体系的优化
1.2.1 Taq DNA聚合酶用量对ISSR-PCR的影响
通过5种不同Taq DNA聚合酶用量比较(图2)。20 uL反应体系中，Taq DNA聚合酶用量在0.75 U时，扩增条带比较弱，且条带数少，当Taq酶用量为1.0~1.75 U时，均能扩增出明显条带，在1.25 U时扩增条带最清晰，因此，Taq酶用量在1.25 U时为最佳。
 

图2 Taq DNA聚合酶用量对ISSR反应的影响 注: M: 100 bp DNA marker; 1~5: Taq DNA聚合酶用量分别为0.75 U, 1.0 U, 1.25 U, 1.5 U和1.75 U Figure 2 The effect of different Taq DNA Polymerase concentrations on ISSR reaction Note: M: 100 bp DNA marker; 1~5: Taq DNA Polymerase concentration is 0.75 U, 1.0 U, 1.25 U, 1.5 U and 1.75 U, respectively

1.2.2 模板 DNA用量对ISSR-PCR的影响
试验设置模板 DNA的终浓度梯度为0.5 ng/μL、1.0 ng/μL、1.5 ng/μL、2.0 ng/μL、3.0 ng/μL、4.0 ng/μL (图3)，结果模板 DNA用量在0.5 ng/μL时扩增条带较模糊，1.0~4.0 ng/μL时均能扩增出清晰带型，通过多次重复比较试验，且从经济角度考虑，1.5 ng/μL的模板用量可以满足丽穗凤梨ISSR-PCR反应的要求。
 

图3 DNA浓度对ISSR反应的影响 注: M: 100 bp DNA marker; 1~6: DNA浓度依次为 0.5 ng/μL, 1.0 ng/μL, 1.5 ng/μL, 2.0 ng/μL, 3.0 ng/μL和4.0 ng/μL Figure 3 The effect of DNA concentrations on ISSR reaction Note: M: 100 bp DNA marker; 1~6: DNA concentration is 0.5 ng/μL, 1.0 ng/μL, 1.5 ng/μL, 2.0 ng/μL, 3.0 ng/μL and 4.0 ng/μL, respectively

1.2.3 引物浓度对ISSR-PCR的影响
试验中引物浓度的变化对产物的多少和条带的亮度影响较大(图4)，引物浓度在0.5~1.0 μmol/L时虽然能扩增出产物，但是条带数少且有些扩增条带较弱；1.25~2.0 μmol/L时均能扩增出清晰的条带，经重复比较，以1.5 μmol/L时，反应最稳定，条带清晰，故将引物浓度确定为1.5 μmol/L。
 

图4 引物浓度对ISSR反应的影响 注: M: 100 bp DNA marker; 1~6: 引物浓度依次为 0.5 μmol/L, 0.75 μmol/L, 1.0 μmol/L, 1.25 μmol/L, 1.5 μmol/L 和2.0 μmol/L Figure 4 The effect of primer concentrations on ISSR reaction Note: M: 100 bp DNA marker; 1~6: Primer concentration is 0.5 μmol/L, 0.75 μmol/L, 1.0 μmol/L, 1.25 μmol/L, 1.5 μmol/L and 2.0 μmol/L, respectively

1.2.4  dNTPs浓度对ISSR-PCR的影响
由图5可见，当dNTPs浓度为0.05 mmol/L和0.6 mmol/L时没有扩增条带；0.1 mmol/L时条带缺失现象严重，且多数条带模糊不清；当dNTPs浓度为0.2~0.4 mmol/L时扩增带型基本一致，但0.2 mmol/L时扩增条带最清晰，因此dNTPs浓度变化对PCR产物影响较大，最终dNTPs最佳浓度为0.2 mmol/L。
 

图5  dNTPs浓度对ISSR反应的影响 注: M: 100 bp DNA marker; 1~5: dNTPs浓度依次为0.05 mmol/L, 0.1 mmol/L, 0.2 mmol/L, 0.4 mmol/L 和0.6 mmol/L Figure 5 The effect of dNTPs concentrations on ISSR reaction Note: M: 100 bp DNA marker; 1~5: dNTPs concentration is 0.05 mmol/L, 0.1 mmol/L, 0.2 mmol/L, 0.4 mmol/L and 0.6 mmol/L, respectively

1.2.5 Mg²⁺浓度对ISSR-PCR的影响
Mg²⁺ 浓度对ISSR-PCR反应的特异性及扩增条带数的影响较大(图6)。随着 Mg²⁺ 浓度增加，扩增条带数先增加后减少，当Mg²⁺ 浓度为1.5 mmol/L时扩增产物最为丰富，且条带最清晰。随着浓度增加，条带逐渐模糊，当浓度为2.5 mmol/L时产生非特异性扩增。因此，最终确定为1.5 mmol/L的Mg²⁺浓度为最适浓度。
 

图6 Mg2+浓度对ISSR反应的影响 注: M: 100 bp DNA marker; 1~4: Mg2+浓度依次为1.0 mmol/L, 1.5 mmol/L, 2.0 mmol/L和2.5 mmol/L Figure 6 The effect of Mg2+ concentrations on ISSR reaction Note: M: 100 bp DNA marker; 1~4: Mg2+ concentration is 1.0 mmol/L, 1.5 mmol/L, 2.0 mmol/L and 2.5 mmol/L, respectively

1.3 ISSR-PCR反应体系的确立及稳定性鉴定
根据上述各影响因子试验结果，最终确定优化后的20 uL反应体系中10× PCR Buffer 2.0 μL，25 mmol/L MgCl₂ 1.2 μL，10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，5 U/μL Taq酶 0.25 μL，10 μmol/L引物3.0 μL，20 ng/μL模板1.5 μL，ddH₂O补充至20 μL。应用上述反应体系，进行引物筛选，筛选得到的引物随机选取2条，对23个品种进行PCR扩增(图7)，引物U808和U834对每份DNA样品均能扩增出条带清晰、多态性丰富的DNA片段，说明该ISSR-PCR反应体系稳定可靠，适用于丽穗凤梨基因组DNA的ISSR-PCR扩增反应。
 

图7 引物U808和U834在23个丽穗凤梨品种中的扩增图谱 注: A: 引物U808; B: 引物U834; M: 100 bp DNA marker Figure 7 ISSR profiles of 23 cultivars in Vriesea cultivars amplified by primer U808 and U834 Note: A: Primer U808; B: Primer U834; M: 100 bp DNA marker

             
2 讨论
ISSR-PCR 反应受反应组分变化影响较大，此外，不同植物种类的PCR扩增反应体系存在一定的差异(陈丽静等, 2011; 刘立军等, 2006)。目前尚无丽穗凤梨ISSR标记的相关报道，因此，建立丽穗凤梨ISSR优化体系是必要的。大多数研究者对植物进行PCR扩增前，都会对该植物进行反应体系的优化，一般采取两种方法：第一是运用正交试验进行优化设计(张飞等, 2009; 李健等, 2011; 邹小云等, 2010)，但是其有可能得到的实验条件并不是最优条件；第二是采用单因子试验(陈丽静等, 2011; 杜萍和崔宝凯, 2011)，对影响ISSR-PCR的各个反应因子进行单独的梯度试验，找出最佳反应条件。本试验采用第二种方法，最终确立了丽穗凤梨ISSR-PCR最佳反应体系。

关于ISSR的反应体系优化的报道(张玉星等, 2011; 吕岩桢等, 2011)很多，成分用量的变化对ISSR-PCR扩增结果影响很大。李萍等(2007)对光萼荷属凤梨与其近源属亲缘关系进行研究时采用的是20 μL ISSR反应体系，其中含10× PCR Buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl₂ 2.0 μL、10 mmol/L dNTPs 0.8 μL、5 U/μL Taq酶 0.2 μL、10 μmol/L 引物1.0 μL、 10 ng/μL模板1.0 μL。然而，本试验优化后的丽穗凤梨ISSR体系中，除PCR Buffer含量与其一致外，其余组分含量与光萼荷属凤梨均存在差异。本试验在优化ISSR-PCR扩增体系时发现，各组分(Taq DNA聚合酶, 模板DNA, 引物浓度, dNTPs, Mg²⁺ 浓度)作为ISSR扩增底物，有一个相对适宜的用量范围，浓度过低，不能满足扩增要求；浓度过高，又降低各组分的活性，影响扩增效果。因此，进行ISSR体系的优化是获得较好研究结果的关键所在。

目前尚无丽穗凤梨品种资源多样性研究。通过筛选得到的其中两条引物对丽穗凤梨23个品种的ISSR扩增结果分析，每个品种均能扩增出清晰条带，引物U808能扩增出13个清晰DNA位点，引物U834能扩增出10个清晰DNA位点，并且多态性均达100%。验证结果证明本研究确立的ISSR-PCR反应体系稳定、可靠，同时也说明ISSR分子标记适合对丽穗凤梨进行遗传多样性分析。这一优化的反应体系为进一步利用ISSR分子标记技术对丽穗凤梨资源鉴定、分类和分子遗传图谱的构建及分子标记辅助育种等分子生物学研究奠定了良好的基础。

3实验材料与方法
3.1实验材料
供试材料为丽穗凤梨属23个品种，2010年采自浙江省农科院花卉研究开发中心观赏凤梨资源圃。

3.2 基因组 DNA 的提取和检测
参照Murray和Thomopson (1980)方法采用 CTAB 法提取丽穗凤梨基因组DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA质量和浓度，并统一稀释至20 ng/μL，保存于-20℃备用。

3.3 ISSR-PCR扩增
PCR扩增选用的引物根据British Columbia大学公布的ISSR引物序列，由上海生工有限公司合成；Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl₂ 、10× Buffer以及100 bp DNA marker均购自杭州鼎国生物技术有限公司。扩增程序是：首先94℃预变性4 min；再94℃变性30 s，56℃复性45 s，72℃延伸60 s，共40个循环；然后72℃延伸 6 min，最后4℃保存。 PCR扩增反应在美国ABI Applied Biosystems 2720型PCR扩增仪上进行。

3.4 ISSR-PCR反应体系的优化试验设计
按照基本扩增反应体系(20 uL反应体系中: 10× PCR Buffer 2.0 μL, 25 mmol/L MgCl₂ 1.0 μL, 10 mmol/L dNTPs 0.8 μL, 5 U/μL Taq酶0.2 μL, 10 μmol/L引物2.0 μL，20 ng/μL模板1.0 μL)，对Taq DNA聚合酶用量、模板DNA含量、引物浓度、dNTPs和Mg²⁺浓度 5个影响ISSR-PCR扩增的主要因素进行单因子试验，各反应参数作4~6个水平的梯度优化(表1)， PCR扩增产物采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，确定各成分的最佳浓度，每个优化好了的参数直接用于下一个优化参数的反应体系中。
 

表1  ISSR反应体系优化设计 Table 1 Design of optimal ISSR reaction system

3.5 ISSR反应体系引物筛选及检测
根据优化的ISSR反应体系，选用2个品种对48条ISSR引物进行PCR扩增，扩增产物采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测，确定多态性较好且条带清晰的引物，选用其中2条引物对23个品种进行多态性扩增检测。

作者贡献
葛亚英、张飞是本研究的实验设计和实验研究的执行人；葛亚英、张飞完成数据分析,论文初稿的写作；沈晓岚、刘建新和张智参与实验设计，试验结果分析；王炜勇是项目的构思者，指导实验设计；张飞进行论文修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由浙江省重大科技专项(2009C12095)、杭州市种子种苗项目(20101532H06)和浙江省农科院创新能力提升项目共同资助。

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