绣球属(Hydrangea)植物主要分布在东南亚和南北美洲的温带地带，是绣球科中最大的属(Mc Clintock, 1957)。18世纪引种至欧洲并驯化为园林植物，在欧洲通过选育和改进，绣球属植物八仙花以其花序硕大及夏日繁花而具有很高的观赏价值，特别是20世纪的法国应用最广。中国有绣球属47种(卫兆芬, 1995)，在我国甘肃、湖南、四川和重庆等地有很多重要绣球属野生资源(孔红, 2006; 彭尽晖等, 2008; 黄林等, 2001; 黄小云等, 2001)，观赏价值很高。但是，我国园林中应用较多的仍旧是20世纪欧洲选育的八仙花品种，因此绣球属植物的野生资源开发利用与新品种选育研究具有十分广阔的前景。

目前，常用的绣球科植物分类还基于1957年Mc Clintock建立的分类系统。卫兆芬对我国的绣球属植物分类进行了修订，修订后的绣球属植物分为5个组：1.离瓣组；2.挂苦子组；3.绣球组；4. 星毛组；5.盖冠组，在绣球组内又分为绣球花系、挂苦树系和腊莲系(卫兆芬, 1994)。在绣球属检索数据库中，多达35种形态学特征用于物种鉴别，但是很难对未知来源的种间杂种进行鉴定和命名，因此，在形态学鉴别的基础上进行分子辅助标记是很重要的手段。

相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)是一种近年来发展起来的新型标记系统，针对基因的开放阅读框(ORFs)设计特殊引物进行PCR扩增的标记技术(Li and Quiros, 2001)，广泛用于目的性状标记、遗传多样性分析及构建遗传图谱等研究领域(李严和张春庆, 2005; 王长林等, 2005; 文雁成等, 2006;张飞等, 2010; 林忠旭等, 2004; 李梅等, 2009)。

近年来，在绣球属植物种质资源调查、保存和鉴定方面取得一些成绩。在比较形态学特征的基础上，对染色体核型进行分析更有利用种质资源的鉴定和利用(Gerbah et al, 2001; Van et al, 2007; Mortreau et al, 2010)。随着分子标记技术的发展，Mortreau和Crespel等运用ISSR标记了八仙花、马桑绣球及其杂交后代(Mortreau et al, 2003; Crespel et al, 2011)；通过运用SSR标记技术分析部分绣球属植物资源的遗传特性，认为在形态学分类基础上进行分子标记能更准确地鉴定绣球属中的新种质(Rinehart et al, 2005; 2006; Rinehart and Reed, 2006)；Joung等运用RAPD和SNP对韩国的野生绣球科植物进行标记，综合RAPD标记、SNPs和顶芽的特征鉴定出未知的野生资源(Joung et al, 2010)；利用SSR标记114个八仙花品种，结果表明八仙花的杂色、重瓣花和四季开花特性具有遗传相似性(Reed and Rinehart, 2007)；运用SSR标记36个圆锥绣球品种，鉴定了一个来源于日本的新基因型以及早花特性基因(Reed and Rinehart, 2009)。SRAP分子技术仅在绣球属植物八仙花上有报道(李艳香等, 2008)，该标记技术的引物没有物种特异性，尤其适用于末知序列物种的标记，不但适合种内也适合于种间的研究。

我国是绣球属植物的分布中心之一，仅利用形态学特征为依据进行野生资源的收集和利用研究局限性很大。因此，为了更好的开发我国丰富的绣球属野生资源，本研究采用SRAP分子标记技术对19份绣球属种质资源进行聚类分析，研究绣球属植物之间的亲缘关系，旨在为绣球属分类、起源、品种选育、栽培应用和新优观赏特性挖掘利用等提供支持。

1结果与分析
1.1绣球属SRAP引物扩增多态性分析
在110 对引物组合中，14对适合绣球属植物，在种间扩增均有多态性，条带清晰，重复性好(见图1)。用筛选出来的14对引物组合扩增绣球属19个材料，获得 235条带，其中232条为多态性带，多态性比率为98.7%，每个引物组合扩增条带为14~20条，平均为16.6条，其中条带最多的组合为 Me1Em3，扩增出20个条带，其中19个多态性条带，表1列出了所选引物以及每对引物所扩增出的多态性条带数。

图1 引物组合Me1Em1对19份绣球属植物的扩增结果 Figure1 SRAP-PCR amplification profiles of 19 species of Hydrangea with primer combination Me1Em1

表1 选用的引物组合及其产生的多态性条带 Table 1 The chosen primer pairs and the number of polymorphic bands generated by them

1.2绣球属SRAP遗传相似性分析
19份绣球属植物之间的遗传相似系数变化范围在0.229 0~0.923 1之间，这说明19份材料遗传变化很大。在8个八仙花栽培品种中，‘Adria’与‘Lavbla’遗传距离最近，相似性系数达0.923 1，其次是栽培品种‘Adria’和八仙花之间；然而，栽培变种H. macrophylla var. Coerulea与其它7个八仙花品种之间的遗传相似系数仅在0.298 7~0.341 8之间；从花部形态特征看，栽培变种H. macrophylla var. Coerulea中心部分为可育花，外围雄蕊瓣化，而其它7个品种雄蕊全部瓣化。相似性系数最低的是伞形绣球和白背绣球之间，仅为0.229 0；其次为伞形绣球与八仙花栽培变种H. macrophylla var. Coerulea。卫兆芬分类结果显示，伞形绣球被划分在绣球组绣球花系内，而白背绣球属挂苦树系。这些相似性系数较为真实地反映了各类群间的亲缘关系。

1.3绣球属UPGMA聚类分析
19份绣球属植物UPGMA聚类分析结果如图2所示。以遗传系数0.43为阀值，将19份绣球属植物聚为4个类群：伞形绣球单独聚为第Ⅰ类群。第Ⅱ类群包括除八仙花栽培变种H. macrophylla var. Coerulea之外的其它7个八仙花品种，该类群亲缘关系密切，植株呈灌木丛状，花序为球形，雄蕊瓣化。蜡莲绣球、阔叶蜡莲绣球、柳叶绣球、大枝绣球、长柄绣球、紫背绣球、光柄绣球、柔毛绣球、和八仙花栽培变种H. macrophylla var. Coerulea聚为第Ⅲ类群，再以遗传系数0.63为阀值，八仙花栽培变种H. macrophylla var. Coerulea和大枝绣球各自被划分为独立的亚类，其它种归为同一亚类。圆锥绣球和白背绣球为第Ⅳ类群，说明二者之间的遗传距离很近。上述结果与《中国植物志》中按形态学分类的结果相吻合，伞形绣球属于绣球花系，7个八仙花品种聚在一起，并与伞形绣球的距离最近，这两个类群均属于绣球花系；第三类群都属于蜡莲系；第四类群归为挂苦树系。

图2 19份绣球属植物UPGMA聚类分析 Figure 2 A UPGMA dendrogram of genetic relationships among 19 species of Hydrangea in China

2讨论
2.1 SRAP标记的效率及多态性
SRAP 引物具有通用性，任意的正向引物均能和反向引物组合搭配，因此用少量的引物即能获得多个引物对，引物使用效率很高。本研究利用10个正向引物和11个反向引物组合成110对引物，对19份绣球属植物进行扩增，结果表明，仅14对引物组合能产生多态性丰富的清晰条带，而且SRAP标记的多态性差异较大，从 13-20条不等，从表3可发现，扩增的多态性与正向引物有关，在10条正向引物中，仅5条引物能与反向引物组合扩增出多态性条带，特别是Me1能与多条反向引物搭配。因此，在引物筛选时应首先筛选合适的正向引物，从而减少浪费，提高效率。

2.2 SRAP标记研究绣球属植物遗传多样性的可行性
本研究利用优化后的SRAP-PCR体系对19份绣球属植物进行扩增和检测，结果表明，SRAP标记能很好反映不同个体DNA分子水平上的差异，不同种和品种的多态性丰富；通过遗传相似系数和聚类分析，不同种和品种之间存在遗传差异。基于SRAP标记的聚类结果与基于形态特征的传统分类结果是基本相符的。 Rinehart等运用SSR对绣球属植物进行遗传分析，不同种之间的差异64.7% (Rinehart et al, 2006)，低于本项研究中的多态性比率98.7%，可见SRAP提供了更丰富的遗传信息，可以获得更可靠的结果。因此，在形态学研究的基础上，SRAP 标记不仅能用于遗传多样性分析，还可用于新品种的鉴定和系统进化方面的研究。

八仙花栽培变种H. macrophylla var. Coerulea与其它7个八仙花栽培品种的遗传相似系数在0.298 7~0.34 8之间，表明它们之间亲缘关系较远。聚类分析结果发现，八仙花栽培变种H. macrophylla var. Coerulea聚在第Ⅲ类群，属于蜡莲系，与其它8份材料的遗传相似系数在0.486 8~0.554 2之间，从花部形态特征观察，八仙花栽培变种H. macrophylla var. Coerulea为伞房状聚伞花序；花二型；放射花萼4片，菱状卵形，先端渐尖，全缘；孕性花小；与该类的野生种具有一定的相似性，说明它们之间的亲缘关系比较近，由此推论该栽培品种可能是蜡莲系某一种的变异，但八仙花栽培变种H. macrophylla var. Coerulea的遗传起源还有待进一步验证。

绣球属植物资源丰富，种间杂种的鉴别需在比较形态学特征的基础上，借助SRAP分子标记方能获得更可靠的结果，因此，该分子标记适用于种间遗传关系的分析。

3材料与方法   
3.1材料
19份绣球属植物材料，分别引自湖南、杭州、河北，于2007年成功移栽至湖南农业大学教学花卉基地，详见表2。

表2 材料来源 Table 2 Materials sources

3.2方法
3.2.1总DNA的提取
选取各种材料幼嫩叶片5 g，按Murray和Thompson的CTAB法(Murry and Thompon, 1980)进行DNA提取。用紫外分光光度计检验DNA质量，并结合1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，最终将DNA稀释为50 ng/μL，在-20℃保存。

3.2.2 SRAP-PCR反应体系
通过单因子分析法，确定绣球属最佳反应体系体积为25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，DNA模板量30 ng，dNTPs浓度0.6 mmol/L，Mg²⁺浓度1.6 mmol/L、引物浓度为0.2 μmol/L，Taq聚合酶量3.5 U。扩增反应在PTCl00 PCR仪上完成，扩增程序：94℃下预变性4 min，94℃下变性1 min，35℃下退火1 min，72℃下延伸2 min，循环5次，在后30个循环中将退火温度将至55.5℃，最后72℃下延伸5 min。扩增产物在含有EB的2%琼脂糖凝胶电泳分离，银染观察和评价。采用Li等(2009)发表的引物，包括10条正向引物，11条反向引物(见表3)，110对引物组合。

表3 SRAP引物序列 Table 3 The sequences of SRAP primers

3.2.3数据统计
试验中条带统计软件为Cross-Cherker指纹图谱分析软件，采用人工辅助读带，有扩增条带记为1，条带不清晰或无带记为0。聚类分析利用NTSYS -pc 2.1软件，采用DICE相似系数、非加权组平均法(Unweighted Pairgroup Method and Arithetic Average, UPGMA)进行聚类，并绘出聚类分析树状图。

作者贡献
陈海霞和彭尽晖是本研究的实验设计和实验研究的执行人；陈海霞完成数据分析、实验设计和试验结果分析；彭尽晖是项目的构思者和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由湖南省科技厅重点项目(2010NK2007)资助。作者感谢已毕业研究生李艳香同学在本实验过程中的帮助。感谢两位匿名的同行评审人的评审建议和修改建议。
 
参考文献
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