高粱起源于非洲，是世界上仅次于玉米、水稻、小麦和大麦的第五大粮食作物(段永红等, 2009)。高粱具有耐旱、耐涝、耐贫疮、耐盐碱等多重抗性，抗逆性强，广泛分布于干旱、半干旱和低洼易涝地区，具有粮饲、造酒、帚用、编织等多种用途。在我国，高粱也是重要的旱粮作物，对稳定粮食产量和保证粮食供应也曾起过不可低估的作用(邵艳军和山仑, 2004)。

近年来，在巨大经济利润的驱动下，不法之徒偷窃高粱育种材料和非法扩繁高粱种子，严重损害了育种家权益和农民利益。作为常异交作物，高粱本身遗传基础复杂，加之我国高粱品种遗传基础较为狭窄，使得品种特异性的判定十分困难。

虽然形态特征描述仍然是高粱品种DUS测试的主要依据，但在审理侵权纠纷案件时，很难根据形态特征判定侵权行为。DNA指纹图谱分析可以非常准确地认定被诉品种与被侵权品种的同一性，从而更好地保护品种权人的合法利益。因此，开展高粱DNA指纹图谱鉴定技术方法研究并形成鉴定技术标准，构建高粱DNA指纹图谱数据库，可以为开展我国高粱已知品种的DNA指纹图谱数据采集和品种权纠纷、司法维权提供技术支撑。

国际植物新品种保护联盟(UPOV)已将SSR标记技术和单核苷酸多态性技术(SNP)推荐为适合构建指纹图谱数据库的两种技术，认为SSR标记技术是目前最为成熟的技术。鉴于SSR标记具有数量丰富、多态性高、信息量大、共显性遗传、稳定性好、技术简便、数据易于交流等优点和国内外应用情况，应建立基于SSR标记的作物品种基因型数据库。而如何从数目庞大的引物库中筛选出扩增条带清晰、重复性好且分辨能力强的核心引物是构库的关键。因而，本研究以119份高梁种质为试材，筛选确立适于高梁DNA指纹图谱库构建的核心SSR引物，研究结果对于在分子水平上开展高梁品种鉴定、品种审定和品种权保护具有重要意义。

1 结果与分析
1.1 SSR引物初筛结果
以表2中编号1~8的高梁种质为试材，基于本实验室构建的适宜的PCR扩增体系及扩增程序，对实验室搜集并合成的288对高粱SSR引物进行初筛(图1)，筛选出能够有效扩增、带型清晰且多态性高的引物138对。
 

图1 引物xtxp123初筛结果 注: 泳道编号与表1相同 Figure 1 The result of preliminary screening for primer xtxp123 Note: The code for lanes is the same as table 1

1.2 SSR引物复筛结果
另以代表不同生态区、不同类型、不同遗传背景的60份高粱种质(表2, 编号9~68)为试材，基于扩增质量好、多态性水平高、在染色体上分布均匀、扩增片段大小适中、易于进行多重PCR的原则，从初筛确定的138对高粱SSR引物中复筛出50对引物(图2)，确定适合于该引物的标准样品，进行荧光基团修饰并用于最终筛选。
 

图2 引物xtxp424复筛结果 注: M: 分子量标准D2000; 9~68: 编号与表1相同; a1~a2: 等位基因1~2 Figure 2: The result of second screening for primer xtxp424 Note: M: Molecular weight standard D2000; 9~68: The code for lanes is the same as table 1; a1~ a2: Alle1 1~allele 2

1.3 SSR引物终筛结果
另从51份高粱种质(表2, 编号69~119)随机选取10份为试材，在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳上比较验证复筛确立的50对常规SSR引物与荧光修饰引物的扩增结果，剔除9个存在问题的引物(未启动扩增、带型不一致等, 图3)，最终选择常规引物与荧光修饰引物带型相一致且重复度好的41对SSR引物，并作为构建高梁DNA指纹图谱数据库的核心引物。
 

图3 荧光引物与常规引物的扩增产物 注: A: 引物txp228未启动扩增; B: 引物cup63扩增无多态性; 1~10; 11~20: 依次为荧光引物和常规引物扩增产物 Figure 3: The amplification fragments for fluorescent primer and conventional primer Note: A: Amplification failure for primer txp228; B: No polymorphism for primer cup63; 1~10 and 11~20 are amplified fragments for fluorescent primer and conventional primer, respectively

结果表明，41对SSR引物在119个高梁材料间共检测出193个等位基因变异，每对引物检测出2~9个等位基因，平均4.7个。采用Popgene软件，对41对引物的分辨能力进行综合评估(表1; 图4)。
 

表1 41对核心引物清单 Table 1 The list of 41 core primers 注: 序号为实验室引物编号 Note: The number is the code of laboratory primers

图4 41对引物在高粱染色体上的分布图 Figure 4 The distribution of 41 primers among 10 chromosomes of sorghum

2 讨论
核心引物的筛选确立是SSR标准实验体系的重要组成部分，也是SSR指纹鉴定商业化的关键环节，对于高梁DNA指纹库的构建具有重要意义。核心引物的确立，不但降低了合成引物的成本，而且大大减轻了引物筛选的工作量，并使得不同研究者的指纹图谱可以相互比较和整合。赵久然等(2003)早已筛选确立适用于玉米自交系和杂交种指纹图谱绘制的SSR核心引物，并成功应用于玉米品种DNA指纹数据采集、品种产权纠、品种审定等方面。然而，在高粱DNA指纹库构建的核心SSR引物筛选方面的相关报道较少。

詹秋文等(2008)以42份高粱和苏丹草为试材，从95对SSR引物中最终筛选出3对SSR核心引物，构建42份高粱和苏丹草的SSR数字指纹。王黎明等(2011)以国内外142份甜高粱种质资源为试材，从103对SSR引物中筛选出41对多态性引物，并最终确定11对引物用于构建142份品种资源的分子身份证。然而，詹秋文等(2008)研究中的材料和引物数量均较少，而王黎明等(2011)主要针对国内外甜高粱种质。本研究所选用的119份高粱种质包含地方品种、常规种(含有国外种质、保持系和恢复系)和杂交种等在内的全部品种类型；所选用的引物涵盖目前国内外最新研究中所开发和使用的核心引物；引物筛选标准较为严格，包括在染色体上分布均匀，扩增带型清晰、稳定且多态性水平高；既适合利用普通DNA片段检测技术平台(如变性聚丙烯酰胺凝胶结合银染技术)，又适合高通量DNA片段检测技术平台(如DNA测序仪)检测；此外，还兼顾扩增片段大小适中、易于进行多重PCR等原则。

总之，本研究提出了适于高梁DNA指纹图谱库构建的一套核心引物，这批引物用于高粱DNA指纹图谱库构建是完全可行的，既为中国高粱品种标准DNA指纹库构建奠定了基础，又为开展我国高梁已知品种的DNA指纹图谱数据采集、品种权纠纷和司法维权提供技术支撑。

3 材料与方法
3.1 供试材料
本实验收集由吉林省农业科学院作物育种研究所、农业部植物新品种测试(公主岭)分中心等单位提供的高粱材料共计119份(表2)。品种类型包括地方品种、常规种(含有国外种质，下简称F；包括保持系和恢复系，下分别简称B和R)和杂交种。

 

表2 119份高梁材料清单 Table 2 The list of 119 sorghum accessions

本实验搜集并选取分布在高粱10条染色体上的SSR引物共计288对(表3)，其主要来源于法国农业发展国际合作研究中心(CIRAD)、国际热带半干旱地区作物研究所(ICRISAT)、中国农业科学院(CAAS)共同开发的48个SSR引物试剂盒，Mace等(2009)的高密度一致性连锁图谱以及Mace等(2008)等文献中所使用的。引物由北京三博远志公司合成。

 

表3 288对SSR引物清单 Table 3 The list of 288 SSR primers

3.2 DNA提取 
本实验采用CTAB法(余传涨等, 2010)并进行了适当的优化：(1)称适量样品，液氮下迅速磨成粉末；(2)将粉末转入2.0 mL Eppendorf管中，加入65℃预热的CTAB缓冲液700 µL，并使其混匀；(3)65℃水浴加热45 min，不断地轻轻倒转摇动。水浴后，取出离心管，冷却至室温；(4)通风橱下加入700 µL的氯仿:异戊醇 (24:1)，轻轻倒转摇动5~10 min；(5)室温下12 000 r/min离心10 min，用去头枪尖将上清转至一新2.0 mL Eppendorf管中；(6)加入10 µL RNA酶溶液(10 mg/mL)，37℃下温浴30 min；(7)重复4~5步骤；(8)加入-20℃预冷的异丙醇或无水乙醇于2.0 mL Eppendorf管中，轻轻混匀。-20℃冰箱静置一段时间后，至DNA凝集，室温下钩出DNA；(9)76 %乙醇洗涤两次，洗涤完毕后，将DNA晾干；(10)加入适量的1×TE (PH 8.0)溶解于试管中，4℃下保存备用。取2 μLDNA溶液，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。

3.3 PCR扩增
扩增体系：采用10 µL反应体系，其中含1×PCR Buffer²⁺ (含2 mmol/L Mg²⁺)，100 µmol/L dNTP，0.24 µmol/L SSR引物，0.4 U Taq DNA聚合酶，20 ng DNA模板，其余用双蒸水补足。

扩增程序为94℃预变性10 min，1个循环；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共36个循环(根据引物特点可作适当调整)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。扩增反应在Bio-Rad公司MyCycler™ PCR仪上进行。

3.4电泳检测
SSR扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离。70 W预电泳45 min，70 W电泳45 min。银染：将凝胶板置于10%醋酸溶液固定20 min；双蒸水漂洗3 min；在2 L新配的染色液(3g AgNO₃)中染色20~30 min；双蒸水快速漂洗1次，时间不超过10 s；2L显影液(25 g NaOH+7 mL甲醛溶液)显影；10%醋酸溶液中定影5 min；双蒸水漂洗5 min后置于室温下自然晾干。

3.5数据统计分析
SSR扩增产物以0、1、9统计建立数据库。在相同迁移率位置上，有带记为1，无带记为0，缺失数据记为9。采用Popgene1.32软件(Yeh et al., 1999)分别计算：(1)总等位变异数(number of alleles, Na)；(2)有效等位变异数(effective number of alleles, Ne)；(3)Shannon-Weaver指数(Shannon’s information index, I)；(4)基因流(gene flow, Nm)；(5) Nei期望杂合度(expected heterozygosity, He)；(6)多态性信息量(polymorphism information content, PIC)。

作者贡献
李晓辉和杨德光负责实验设计和论文修改；王凤华参与实验设计和数据分析；郝彩环整理和收集实验材料；王晶和张春宵是本研究的具体执行人，共同开展试验、数据分析和论文写作。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由农业部“DUS测试品种、信息DNA测试技术研究”项目(200903008)，“DNA指纹图谱鉴定技术方法研究和数据采集”课题(200903008-07)，“高梁DNA指纹图谱鉴定技术标准研制及数据库构建”子课题(200903008-07-08)资助。感谢吉林省农业科学院作物育种研究所、农业部植物新品种测试(公主岭)分中心等单位为本研究提供实验材料。感谢匿名的同行评审人的评审建议和修改建议。

参考文献
Duan Y.H., Sun Y., Yi Z.B., and Qian J., 2009, Construction of an simple sequence repeats linkage map of Sorghum bicolor (L) moenc, Shanxi Nongye Daxue Xuebao (Journal of Shanxi Agricultural University (Natural Science Edition)), 29(4): 315-319 (段永红, 孙毅, 仪治本, 钱锦, 2009, 高粱SSR分子连锁图谱的构建, 山西农业大学学报 (自然科学版), 29(4): 315-319)
 
Emma S.M., Jean-Francois R., Sophie B., Patricia E.K., Robert R.K., Andrzej K., Peter W., Ling X., Kirsten H. and David R.J., 2009, A consensus genetic map of sorghum that integrates multiple component maps and high-throughput Diversity Array Technology (DArT) markers, BMC Plant Biology, 9: 1-14
 PMid:19123941    PMCid:2630931
 
Mace E.S., Xia L., Jordan D.R., Halloran K., Parh D.K., Huttner E., Wenzl P., and Kilian A., 2008, DArT markers: diversity analyses and mapping in sorghum bicolour, BMC Genomics, 9: 1-11
 http://dx.doi.org/10.1186/1471-2164-9-26
  
Shao Y.J., and Shan L., 2004, Advances in the research of drought resistance in sorghum, Zhongguo Nongxue Tongbao (Chinese Agricultural Science Bulletin), 20(3): 120-123 (邵艳军, 山仑, 2004, 高粱抗旱机理研究进展, 中国农学通报, 20(3): 120-123)
 
Wang L.M., Jiao Sh.J., Jiang Y.X., Yan H.D., Su D.F., and Sun G.Q., 2011, Establishment of molecular identity in 142 sweet sorghum varieties, Zuowu Xuebao (Acta Agronomica Sinica), 37(11): 1975−1983 (王黎明, 焦少杰, 姜艳喜, 严洪冬, 苏德峰, 孙广全, 2011, 142份甜高粱品种的分子身份证构建, 作物学报, 37(11): 1975−1983)
 
Yeh F.C., and Yang R.C., 1999, POPGENE Version 1.31, http://www.ualberta.ca/fyeh/popgene

Yu C.Z., Zhai G.W., Zou G.H., Tao Y.Z., and Wang H., 2010, Assessment of genetic diversity among 41 sorghum varieties using SSR marker, Jiangsu Nongye Xuebao (Jiangsu Journal of Agricultural Sciences), 26(2): 248-253 (余传涨, 翟国伟, 邹桂花, 陶跃之, 王华, 2010, 41个高粱品种遗传多样性的SSR标记检测, 江苏农业学报, 26(2): 248-253)
 
Zhan Q.W., Li J.Q., Wang B.H., and Li Y.F., 2008, Establishment of DNA fingerprinting for 42 sorghum and sudangrass accessions and 2 sorghum-sudangrass hybrids, Caoye Xuebao (Prataculturae Sinica), 17(6): 85-92 (詹秋文, 李杰勤, 汪保华, 李云飞, 2008, 42份高粱与苏丹草及其2个杂交种DNA指纹图谱的构建, 草业学报, 17(6):85-92)
 
Zhao J.R., Wang F.G., Guo J.L., Chen G., Liao Q., Sun S.X., Chen R.M., and Liu L.Zh., 2003, Series of Research on Establishing DNA Fingerprinting Pool of Chinese New Maize Cultivars II.Confirmation of a Set of SSR Core Primers Pairs, Yumi Kexue (Journal of Maize Sciences), 11(2): 3-5, 8 (赵久然, 王凤格, 郭景伦, 陈刚, 廖琴, 孙世贤, 陈如明, 刘龙洲, 2003, 中国玉米新品种DNA指纹库建立系列研究II.适于玉米自交系和杂交种指纹图谱绘制的SSR核心引物的确定, 玉米科学, 11(2): 3-5, 8)