大白菜(Brassica campestris L. ssp pekinensis)为十字花科芸薹属叶用蔬菜，起源于我国北方，是人们生活中不可缺少的一种重要蔬菜，栽培面积和销售量在我国居各类蔬菜之首，可在全国各种条件气候下栽培，因此广受农户欢迎。大白菜的品种较多，不同品种的营养和经济价值以及适宜的栽培方式也不尽相同，同时每种品种的种子质量直接影响农户的产量和经济效益，而种子纯度又是种子质量的重要影响因素和评价指标，因此保证种子的纯度对农户尤为重要。鉴定种子纯度的方法多为传统的田间形态学观察，需要一个较长的育种过程，而且受各种环境条件的影响也较大，往往时间较长而且结果可能存在偏差，这种方法对于农户而言虽然传统，但在时间上存在很大的不利因素，可能因此而错过最佳的育种时机，直接影响经济收益。因此，开发一种快速准确的种子纯度鉴定方法已成为各类种子科研院所、质检机构以及企业和农户共同关注的问题(赵振卿等, 2011)。

近年来，种子纯度鉴定的方法有十多种，发展速度也较快，从种子、幼苗形态及物理化学的常规鉴定法到蛋白质及同工酶的电泳鉴定法再到DNA水平的分子标记鉴定法，鉴定周期及时间上都已大大缩短，但相比较而言，DNA水平的分子标记鉴定法以其信息量大、遗传性稳定、检测速度快、操作简便等突出优点在多种鉴定方法中占据了较大优势，并且也得到了广泛应用(李淑娟, 2003; 田雷等, 2001)。

EST-SSR标记是分子标记鉴定方法之一，随着GenBank上公布的常见物种的EST序列信息日渐丰富，利用EST数据库开发SSR引物较其它分子标记方法更加便捷、信息量大、花费低、效率高，同时也具备SSR标记的共显性、多态性高、实验程序简单等优点，较适合于农户育种的需要(张晗等, 2010)。

本研究以10份市售大白菜杂交种及其双亲为试验材料，通过GenBank数据库上公布的大白菜EST序列，设计合成引物，通过比较杂交种及双亲的特征谱带，筛选杂交种呈现双亲共显性的互补带型的引物，建立准确快速的EST-SSR标记技术鉴定大白菜杂交种种子纯度的检测方法，为大白菜杂交种种子纯度分析提供理论基础。

1结果与分析
1.1大白菜叶片基因组DNA提取方法
利用改良CTAB方法提取大白菜叶片基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。从图中可以看出，所提取的基因组DNA主带清晰，整齐一致，没有明显降解，可用于下一步PCR扩增。

图1 大白菜基因组DNA电泳图 Figure 1 Electrophoretogram of Chinese cabbage genome

1.2引物筛选结果
利用EST-SSR标记技术对天津科润蔬菜研究所提供的大白菜杂交种及其双亲进行种子纯度鉴定，通过合成的30对核心引物，比较杂交种及双亲特征谱带的差异，筛选杂交种呈现双亲共显性的互补带型的引物，其中7对引物出现杂交种带型为双亲的互补带型，可用于大白菜杂交种种子纯度的鉴定，仅应用其中3对引物即可覆盖10个品种的大白菜杂交种种子纯度的鉴定。引物序列见表1，应用3对引物对10个品种大白菜进行纯度鉴定的图谱如图2、图3、图4所示。

表1 引物序列 Table 1 Primer sequences

图2 引物1大白菜杂交种纯度鉴定 Figure 2 Results of purity identification of Chinese cabbage hybrids by primer No.1

图3 引物9大白菜杂交种纯度鉴定 Figure 3 Results of purity identification of Chinese cabbage hybrids by primer No.9

图4 引物26大白菜杂交种纯度鉴定 Figure 4 Results of purity identification of Chinese Cabbage hybrids by primer No.26

1.3利用筛选到的3对引物进行田间大白菜纯度鉴定
对10份大白菜杂交种进行田间随机取样，每个品种的大白菜各取单株60株，利用嫩叶进行DNA提取，应用筛选得到的3对EST-SSR引物，鉴定每个品种大白菜的纯度，并与田间形态观察结果对比，从而确定引物的适用性，两种方法纯度鉴定结果如表2所示。

表2 两种方法纯度鉴定结果 Table 2 Results of two methods for purity identification

2讨论
目前对于种子纯度的鉴定方法已经发展到分子水平，分子标记技术可以直接反应DNA水平上的差异，因此已成为种子纯度鉴定的主要发展趋势。DNA分子标记技术主要包括：扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA (RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)、简单重复序列(SSR)等方法。其中，AFLP虽然稳定性和重复性较高，但技术本身对DNA的纯度和内切酶的质量要求严格，在应用上收到了限制；RAPD检测受环境条件影响较大且稳定性和重复性欠缺；RFLP特异性强、准确性高，但由于应用到探针标记，价格较高，难以普及。而SSR标记不受环境条件影响，多态性高，重复性稳定，且价格低廉，操作简便，同时是共显性标记，因此已被杂交种纯度鉴定广泛应用。

而基于近年来GenBank上公布的常见物种的EST序列信息日渐丰富，且获取简便，没有任何费用，因此利用EST数据库开发SSR引物，不仅保留了SSR标记的所有特点，而且凸显了其便捷、信息量大、花费低、效率高等优势，适合于技术的推广和普及。目前EST-SSR 标记已经应用于水稻、葡萄、小麦、黑麦、大麦和扁桃、玉米、甘蔗等(Cho et al., 2000; Nicot et al., 2004; Thiel et al., 2003; Xu et al., 2004; Cordeiro et al., 2001; 杨春霞等, 2011)植物进行分子连锁图谱构建和遗传多样性分析。因此，EST-SSR分子标记在蔬菜类作物和其他作物的遗传图谱构建、比较基因作图、物种亲缘关系鉴定、遗传多样性研究、品种鉴定、新基因的发掘等方面有很大的应用潜力(葛佳等, 2005)。

本研究利用EST-SSR分子标记技术对大白菜进行种子纯度鉴定，以10份大白菜杂交种及其双亲为试验材料，用30对EST-SSR引物进行筛选。通过筛选应用其中3对引物可对10份大白菜的全部品种进行纯度鉴定，即在杂交种F₁代中均产生与父本和母本互补的共显性带型，并对所筛选引物进行田间验证，验证结果为大白菜的EST-SSR分子标记方法与田间形态观察方法纯度鉴定结果一致，即所建立的技术可用来鉴定大白菜杂交种的种子纯度。并且该技术在不计算DNA提取过程耗时的情况下，PCR耗时2 h，EST-SSR分析60~90 min，所以本研究的检测方法在4 h之内即可完成种子纯度鉴定工作，具有快速、低成本、操作方便等优势。

3试验材料与方法
3.1试验材料
以10份市售大白菜杂交种及其双亲为试验材料，由天津科润蔬菜研究所提供，10份大白菜杂交种品种名称见表3。

表3 品种名称及编号 Table 3 Cultivars and No. of hybrid

3.2试验方法
3.2.1 EST-SSR引物设计与合成
通过GenBank上公布的大白菜EST序列信息，应用CMD SSR Server (http://www.cottonmarker.org/cgi-bin/cmd_ssr)在线设计软件，共设计了30对核心引物，引物由上海生工合成。

3.2.2 DNA提取
利用改良CTAB法提取大白菜叶片基因组DNA (王永等, 2008)。将获得的植物组DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

3.2.3引物筛选
以大白菜杂交种及其父本和母本的基因组DNA为模板，分别对30对EST-SSR引物进行扩增，扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离、染色，筛选杂交种带型为父母本互补的引物。

3.2.4 PCR扩增体系及程序
PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq® Master Mixes 5 μL，上游和下游引物10 μmol/L各0.25 μL，供试品种大白菜基因组DNA模板，浓度50 ng/μL，1 μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为94℃预变性5 min，35个扩增循环(94℃ 1 min，53.5℃ 45 s，72℃ 45 s)；72℃延伸7 min，4℃保存。

3.2.5田间试验验证
对10份大白菜杂交种进行田间随机取样，每个品种的大白菜取单株60株，用筛选出的3对EST-SSR引物进行纯度鉴定，鉴定结果与田间形态观察结果对比，确定所筛选引物的适用性。

作者贡献
赵新、王永和兰青阔是本研究的实验设计和实验研究的执行人；朱珠和陈锐完成数据分析；余景会和李欧静参与实验设计，试验结果分析；赵新指导实验设计，数据分析，论文写作与修改；王永是项目的构思者和负责人，郭永泽是项目的构思者。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由天津市科技支撑项目(10ZCGYNC00400)和天津市应用基础及前沿技术研究计划(10JCYBJC09300)共同资助。作者对天津科润蔬菜研究所在本实验过程中提供的试验材料表示感谢。感谢匿名的同行评审人的评审建议和修改建议。

参考文献
Zhao Z.Q., Sheng X.G., Yu H.F., Wang J.S., Zhang X.H., and Gu H.H., 2011, Hybrid purity identification of a new cauliflower cultivar zhe 801 by SSR marker, Changjiang Shucai (Journal of Changjiang Vegetables), 18: 18-20 (赵振卿, 盛小光, 虞慧芳, 王建升, 张晓辉, 顾宏辉, 2011, 花椰菜新品种浙801杂交种纯度的SSR鉴定, 长江蔬菜, 18: 18-20)

Li S.J., 2003, Summariy of identification method on seed purity, Qinghai Daxue Xuebao (Journal of Qinghai University), 21(1): 16-19 (李淑娟, 2003, 种子纯度鉴定方法概述, 青海大学学报, 21(1):16-19)

Tian L., Cao M.Q., Wang H., Guo J.X., Zhou N.Y., Sun J., and Jia X.H., 2001, Application of AFLP in the identification of Cabbage seed genuineness and purity Shengwu Jishu Tongbao (Biotechnology Bulletin), 3: 38-40 (田雷, 曹鸣庆, 王辉, 郭晶心, 周乃元, 孙江, 贾希海, 2001, AFLP标记技术在鉴定甘蓝种子真实性及品种纯度中的应用, 生物技术通报, 3: 38-40)

Zhang H., Yao F.X., Liu Y.J., Wang D.J., Xu J.F., and Li Y.Y., 2010, Genetic diversity among major winter wheat cultivars in Huanghuaihai Area of China revealed by EST-SSR, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 8(2): 297-302 (张晗, 姚凤霞, 刘永杰, 王东建, 许金芳, 李汝玉, 2010, 黄淮海地区主要冬小麦品种的EST-SSR遗传多样性分析, 分子植物育种, 8(2): 297-302)

Cordeiro G.M., Casu R., Mclntyre C.L., Manners J.M., and Henry R.J., 2001, Microsatellite markers from sugarcane (Saccharum spp.) ESTs cross transferable to erianthus and sorghum, Plant Sciences, 160(6): 1115-1123
http://dx.doi.org/10.1016/S0168-9452(01)00365-X

Cho Y.G., Ishii T., Temnykh S., Chen X., Lipovich L., McCouch S.R., Park W.D., Ayres N., and Cartinhour S., 2000, Diversity of microsatellites derived from genomic libraries and GenBank sequences in rice (Oryza sativa L.), Theor. Appl. Genet., 100(5): 713-722
http://dx.doi.org/10.1007/s001220051343

Nicot N., Chiquet V., Gandon B., Amilhat L., Legeai F., Leroy P., Bernard M., and Sourdille P., 2004, Study of simple sequence repeat (SSR) markers from wheat expressed sequence tags (ESTs), Theor. Appl. Genet., 109(4): 800-805
http://dx.doi.org/10.1007/s00122-004-1685-x PMid:15146317

Thiel T., Michalek W., Varshney R.K., and Graner A., 2003, Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley (Hordeum vulgare L.), Theor. Appl. Genet., 106(3): 412-422

Xu Y., Ma R.C., Xie H., Liu J.T., Cao M.Q., 2004, Development of SSR markers for the phylogenetic analysis of almond trees from China and the Mediterranean region, Genome, 47(6): 1091-1104
http://dx.doi.org/10.1139/g04-058 PMid:15644967

Yang C.X., Wen Q., Ye J.S., and Zhu P.L., 2011, Development of EST-SSR markers in (Citrus aurantium L.), Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 9(1): 123-127 (杨春霞, 温强, 叶金山, 朱培林, 2011, 枳壳EST-SSR标记的开发, 分子植物育种, 9(1): 123-127)

Ge J., Xie H., Cui C.S., Hong J.M., Ma R.C., 2005, Analysis of expressed sequence tags (ESTs) derived SSR markers in Chinese Cabbage (Brassica campestris L. ssp. pekinensis), Nongye Shengwu Jishu Xuebao (Journal of Agricultural Biotechnology), 13(4): 423-428 (葛佳, 谢华, 崔崇士, 洪剑明, 马荣才, 2005, 大白菜表达序列标签SSR标记分析, 农业生物技术学报, 13(4): 423-428)

Wang Y., Lan Q.K., Zhang L., Zhao X., Zhu Z., and Cheng Y., 2008, Comparison on effect of improved chelex-100 method and CTAB method for transgenic roundup ready Soybean detection, Dadou Kexue (Soybean Science), 27(5): 898-901 (王永, 兰青阔, 张莉, 赵新, 朱珠, 程奕, 2008, 改良Chelex-100法和CTAB法用于转基因抗草甘膦大豆检测效果的比较, 大豆科学, 27(5): 898-901)