高质量的RNA提取成功与否是进行分子生物学研究的前提和基础。目前，许多分子生物学研究，如基因表达分析、基因克隆、cDNA文库构建及转录组测序等都需要高质量的RNA。杨树具有基因组小、遗传多样性丰富、遗传转化系统简单且无性繁殖容易等优点，已成为林木基因组研究的模式植物(程强等, 2009)。杨树在盐胁迫条件下产生大量的多糖及次生代谢物，严重影响了RNA提取的质量和得率。目前已报道多种成功提取植物RNA的方法(林清芳等, 2011; 张倩茜等, 2011; 余发新等, 2010; 赵百慧等, 2010; 林莎等, 2008)，但由于不同植物及相同植物的不同生理时期的物质组成千差万别，因此，RNA提取方法也不尽相同。本研究以盐胁迫处理后的杨树叶片和根为材料，通过对天泽植物RNAout试剂盒、天根RNAplant plus Reagent试剂盒和改良的SDS法提取总RNA，通过RNA纯度、凝胶电泳及反转录分析等途径确定适于盐胁迫后的杨树总RNA提取方法，为后续的基因表达研究奠定基础。

1结果与分析
1.1 3种提取RNA方法的比较
采用凝胶电泳手段对所获得的植物总RNA进行分析是判断RNA质量的一种重要方法，通过对18S和28S条带的完整性可判断RNA有无降解及降解程度(王英等, 2009)。从RNA琼脂糖凝胶电泳图可见，利用天根的RNAplant plus Reagent试剂盒未能提取盐胁迫处理后的107杨叶片组织总RNA (图1A)，提取根组织的RNA也已大部分降解(图1B)；采用天泽柱式植物RNAout在叶和根组织中都提取获得了总RNA，但RNA浓度较低，需提取大量组织材料方可用于后续实验；改良的SDS方法提取效率和质量最佳，28S与18S条带亮度约为1.5:1。这3种提取RNA方法都存在DNA污染，因此，后续实验中需DNA酶进行处理解决。

图1 不同方法提取107杨叶片和根总RNA电泳图谱 Figure 1 Agarose electrophoresis of total RNA extracted from leaf and root of poplar 107 by using different methods

1.2 RNA纯度和浓度
RNA溶液在230 nm、260 nm、280 nm的光密度分别代表杂质(多肽, 酚, 糖等)和蛋白等有机物的吸收植。纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.8~2.1之间，小于1.8表明蛋白或其他有机物污染，大于2.1表明RNA已经降解；OD₂₆₀/OD₂₃₀值＜2.0，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。利用NanoDrop ND-1000微量紫外可见分光光度计测量RNA样品的OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀比值(表1)，采用改良SDS法和柱式植物RNAout试剂盒得到的OD₂₆₀/OD₂₈₀和比值为1.8~2.1，符合标准的比值，纯度较高。

表1 不同方法提取总RNA纯度检测 Table 1 Yield and purity of RNA isolated from different organ in populus with different methods

1.3 RNA样品的cDNA合成及质量检测
利用3种方法提取的RNA作为模板进行反转录，将合成的cDNA进行PCR扩增，以检测RNA的质量。RT-PCR电泳结果如图2所示，改良SDS法所提取的RNA经反转录后，可扩增出目的条带；柱式RNAout法提取根RNA可扩增出目的条带，但条带微弱；RNAplant plus Reagent法所提取的RNA未能扩增出条带，与其所提的RNA质量有关。

图2 杨树UBQ基因的RT-PCR产物 Figure 2 RT-PCR products of poplar UBQ gene

2讨论
目前，对于木本植物不同种、不同部位RNA的提取，研究人员已总结出不同的方法，但在实际操作过程中，用同一套提取方法不能保证获得同样的效果。如柱式RNAout法提取叶片和根中RNA，将所获得的RNA反转录后进行PCR，在叶中不能扩增出目的条带，而在根中扩增出了微弱条带。

杨树受盐胁迫后，会产生大量的次生代谢物，当细胞裂解后就会释放出来，并与多酚氧化酶反应成褐色，其氧化生成多元琨类物质与RNA发生不可逆结合，导致RNA降解、丢失、难溶解(郭丽霞等, 2007; 肖洁凝等, 2003)。在提取液中加入高浓度的β-巯基乙醇可以防止酚类物质被氧化及其与RNA结合。本试验在提取缓冲液中加入5%的β-巯基乙醇防止酚类物质氧化。

植物在短时间内受盐胁迫后，会产生大量的多糖，而多糖的存在则是RNA提取一大障碍，因为多糖的结构与RNA相似，去除多糖的过程中，RNA也将同时被去除，减少RNA产量；另外，含有多糖的RNA沉淀难溶于水，而且多糖可抑制酶活，因此含有多糖的RNA无法用于分子生物学研究(Fang et al., 1992)。本研究中进行了部分改良，采用LiCl沉淀剂选择性沉淀RNA来减少多糖；另外，选择短时间沉淀(如3 min)以减少非RNA沉淀。但是，RNA样品中仍然存在基因组DNA，需进行无RNase的DNase处理，再进行其他试验。

本试验经琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR检测分析，证明了改良SDS法完全适用于盐胁迫下杨树总RNA提取，为后续分子生物学研究奠定了基础。

3材料与方法
3.1材料
将1年生107杨截成长约15 cm的茎段，置于盛有蒸馏水的塑料容器中，不定期更换蒸馏水，以防茎段分泌出的粘液影响生根。待根长至5 cm左右时，将茎段转移至含有0.6% NaCl的Hoagland营养液中胁迫6 h，用去离子水冲洗根部，然后用滤纸吸干根表面水分，迅速剪取叶片和根，用液氮速冻后置于-80℃冰箱保存。

柱式植物RNAout购自天泽公司，RNAplant plus Reagent试剂盒购自天根公司，改良SDS法药品均为自己配制，反转录试剂盒购自Promega公司，引物由北京鼎国公司合成。所需试剂(除含Tris试剂外)用0.1% DEPC于37℃烘箱处理24 h后进行高压灭菌。所需的研钵等玻璃制品于180℃干热处理12 h，以避免RNA酶污染。无DNase和RNase移液器枪头和Eppendrof管购自Axygen公司。

改良SDS提取液：100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L EDTA，2.0% SDS，100 mmol/L DTT，5% 2-β巯基乙醇，pH=7.5 (其中巯基乙醇在使用前加入提取液中至终浓度5%)。

3.2总RNA提取方法
3.2.1柱式植物RNAout方法
称100 mg的叶片和根，经液氮研磨后，按试剂盒操作步骤说明进行RNA提取。

3.2.2 RNAplant plus Reagent试剂盒方法
称取100 mg的叶片和根，经液氮研磨后，按试剂盒操作步骤说明的方法提取。

3.2.3改良SDS法
取100 mg叶片和根置液氮冷冻研磨成粉，迅速置入盛有350 µL水饱和酚、350 µL氯仿和700 µL SDS提取液的Eppendorf管中，涡旋震荡5 min后于4℃ 12 000 r/min离心10 min；上清转入盛有700 µL氯仿的新Eppendorf管，震荡混匀，于4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；上清转入盛有1/4体积的8 mol/L LiCl溶液，常温沉淀5 min；4℃ 12 000 r/min离心10 min；弃上清，用75%乙醇洗沉淀2次，最后短暂离心吸出多余液体，置于真空浓缩仪干燥，加入DEPC处理过的H₂O中溶解RNA，于-80℃保存，备用。

3.3 RNA质量与浓度检测
取1 µL所提取的总RNA，用ND-1000核酸蛋白定量仪检测浓度及纯度。取2 µL含有6×Loading Buffer RNA进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测分析。

3.4 RT-PCR检测
按照Promega公司M-MLV反转录酶操作手册进行。以杨树UBQ基因(BU879229)序列进行引物设计，5'引物P1：5'-GTTGATTTTTGCTGGGAAGC-3'和3'引物P2：5'-GATCTTGGCCTTCACGTTGT-3' (北京鼎国公司合成)。扩增条件为94℃ 5 min；94℃ 20 s→58℃ 20 s→72℃ 20 s，35个循环；72℃ 2 min。取5 µL RT-PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

作者贡献
周祥明是项目的构思者及负责人，同时指导实验设计，数据分析，论文初稿的写作与修改；宋建负责材料的水培、处理、取样、RNA提取检测及论文修改工作；郝志愚完成数据分析；王姝进行试验结果分析。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由天津市应用基础及前沿技术研究计划(10JCYBJC09500)、国际科技合作项目(2011DFA30990)和北京林业大学林木育种国家工程实验室开放课题项目(FOP2010-13)资助；作者感谢天津市农业科学院中心实验室王永、兰青阔在RNA检测方面给予的帮助，《天津农业科学》编辑部梁凤莲在论文撰写中给予的宝贵建议。

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