作物高产离不开优良的品种，种子质量直接关系到“三农”问题。种子纯度是保证优良品种增产潜力得以发挥的关键因素，因而品种纯度检验对保证种子质量具有重要意义。从遗传学角度上来看，品种纯度和真伪鉴定实质上是对品种基因型的鉴定。近年来，随着国家和企业的大量投入，加快了玉米育种速度。品种数量增多给种子管理部门、品种保护部门以及广大的种子生产者、经营者和种植者带来诸多不便，另一方面也给一些单位和个人以可乘之机，经常出现以甲品种充当乙品种、以未审定品种充当审定品种或以劣质品种充当畅销优质品种等现象(左生力等, 2008)。每年省级玉米品种预备试验、区域试验中有很多品种参试，而参试品种的特异性、一致性、纯度以及参试品种与已经审定品种是否雷同或近似，长期以来一直是预备试验、区域试验工作中的重点和难点(朱卫红等, 2007)。以往种子鉴定采用形态鉴别或蛋白质电泳技术，但较难识别和区分。又由于我国玉米生产上使用的亲本自交系较为集中，造成种质基础日趋狭窄，原有的检测方法已不能满足实际需要，实践中迫切需要开发新的检测技术(罗黎明等, 2011; 梅眉和陆璐, 2005; 王凤格等, 2005)用于检测传统鉴定方法难以判别品种间的亲缘关系。

NY/T1432-2007《玉米品种鉴定DNA指纹方法》是中华人民共和国农业行业标准，即玉米(Zea mays L.)品种依据SSR分子标记的DNA指纹鉴定标准方法(张文玲, 2008)。该方法适用于玉米自交系和单交种的品种真实性和品种纯度鉴定，同时可高效、准确地检测生物体中的遗传变异。本文依据该标准检测222个云南玉米新品种的种子纯度，初步建立其指纹图谱，并进行遗传多样性分析，为云南省玉米新品种登记注册、遗传资源评价及亲缘关系分析提供理论依据和技术支持，对规范种业市场以及对玉米新品种权保护具有重要意义。

1结果与分析
1.1 SSR标记多态性分析
222个玉米品种在20对多态性位点上共检测到115个等位基因数(表1)，平均每个标记5.75个，变幅3~9个，其中引物bnlg1450多态性最高，在供试品种中共检测到9个多态性片段；引物bnlg1496和bnlg161次之，分别检测到8个多态性条带；引物mmc0191，umc1225，umc2163表现出较高的多态性，分别检测到7个多态性片段；但引物bnlg439，umc1705多态性差，都只在供试品种中检测到3个多态性条带。20个微卫星标记检测到的等位基因数大致呈梯形分布。20个微卫星标记总的有效等位基因数为85.132 7个(表1)，平均每个标记4.256 6个，变幅1.964 8~7.333 5个，其中引物bnlg161的有效等位基因数最多，为7.333 5个，而引物bnlg439的有效等位基因总数最少，为1.964 8个。20个微卫星标记的有效等位基因数大致呈梯形分布。

用Shannon多样性指数(I)、多态性信息含量(PIC)和标记索引数(MI)来衡量玉米品种的遗传多样性水平(表1)，Shannon多样性指数平均值1.508 7，变化幅度0.851 5~2.042 1；多态性信息含量平均值为0.729 0，变动范围0.491 1~0.863 6；标记索引指数平均值为4.317 5，变幅1.473 3~7.707 0。其中引物bnlg439的I值，PIC值和MI值最小，分别为0.851 5，0.491 1和1.473 3；引物bnlg1450的I值，MI值最大，分别为2.042 1和7.707 0；引物bnlg161的PIC值最大，为0.863 6。

从表1中看出，用来衡量分子标记的多态性指标，即等位基因数(Na)，多态性信息含量(PIC)和标记索引值(MI)，并不完全一致，如引物bnlg1450的检测到等位基因数最多，但多态性信息含量为0.856 3，并不是PIC值的最大引物，PIC值最大的引物是bnlg161，PIC值达0.863 6，而引物bnlg1450的MI值最大，为7.707 0。尽管这3个指标并不完全反应引物的多态性，但是多态性信息含量(PIC)和标记索引值(MI)基本随着引物检测到等位基因数目的增加而增大，即在一定程度上代表SSR标记的多态性。
  

表1 20对SSR引物扩增特性 Table 1 The characteristics of 20 SSR primers for 222 maize cultivars amplification

分析等位基因的出现频率发现，只有少数标记座位上的等位基因出现频率较为均衡，大部分标记座位上的等位基因出现频率差异很大，且在一个标记座位上存在1~2个等位基因的出现频率明显高于其他等位基因，可称其为主导等位基因。从表2可知，引物mmc0191，bnlg1496，bnlg2291和umc1705位点内最大的等位基因频率与最小的等位基因频率的比值(MAX/MIN)分别为2.318 5，2.784 5，2.920 8，1.500 4，表明其标记座位上的等位基因出现频率比较均衡，而其他标记座位上MAX/MIN值均大于3.000 0，表明这些位点上存在主导等位基因现象，其中有5对引物bnlg1792，phi080，phi065，bnlg1191，umc2163的主导等位基因现象突出，其MAX/MIN值大于10.0000，MAX/MIN值分别为29.132 7，13.349 9，13.407 3，10.418 2，14.820 2。
 

表2 20个微卫星标记在不同玉米品种中的等位基因频率 Table 2 Frequency of alleles at 20 SSR loci in 222 maize cultivars

1.2玉米新品种纯度分析
222个玉米新品种的种子纯度测定结果见表3，可以看出222个玉米品种的种子纯度都分布在82%及以上，其中206个玉米种子的纯度≥90%，占所有品种数的92.79%；其中有160个玉米种的种子纯度≥95%，占供试品种总数的72.07%。
 

表3 222个玉米品种种子纯度分布表 Table 3 The seed purity of 222 maize new cultivars

1.3玉米新品种指纹图谱构建
根据扩增产物在聚丙烯酰胺电泳凝胶上的相对位置，并参照100 bp DNA Marker条带位置，确定不同的谱带类型，并按扩增片段从大到小的顺序编号，按照0、1、9统计SSR扩增产物，组成222个玉米新品种的二元数据矩阵，构成222个玉米品种的数字化指纹图谱(保存在云南农业大学农业生物多样性国家技术应用工程中心)。

1.4玉米新品种聚类分析
 222个云南省玉米新品种的遗传相似性系数(GS)变异范围为0.482 1~0.982 1，平均遗传相似性系数为0.655 6，其中文单4号和绿2009的遗传相似性系数最大，为0.982 1，其次为云D007和康农20，为0.947 8，再次为金禾玉1号和滇都8号，昭黄9号和山州2011，分别为0.843 5，0.840 0，说明这些品种间遗传背景相似，亲缘关系较近。而金州玉2号和S-8-1的遗传相似性系数最小，为0.482 1，兴华单7号和和玉808，7203和宣宏2号的遗传相似性系数也较小，都为0.495 7，说明这些品种间的遗传背景差异较大，亲缘关系较远。另外由222个品种之间组成24 531个品种对中，遗传相似性系数大于0.600 0品种对为21 264个，占供试品种对的86.68%，表明供试品种之间的亲缘关系较近，遗传基础狭窄。

据遗传相似值(GS)矩阵，按照UPGMA进行聚类分析，构建222个云南省玉米新品种的遗传关系树状图(图1)。以遗传相似性系数为0.648 5为标准，将222个品种被分成5个类群，类群I和II为2个大类群，III、IV和V为3个小类群。
类群I包括曲辰12号、秋玉1号和海选1号等78个品种，占所有供试材料的35.14%。在遗传相似性系数为0.655 6处，被分成3个亚群，图1中所示分别为亚群IA、亚群IB、亚群IC。其中亚群IA包括曲辰12号、秋玉1号和海选1号等69个品种，占类群I中测试品种数的88.46%。亚群IB只包括3个品种分别为绿星699、路单17号和雅玉78；亚群IC包括CUB201、五谷8567和YS201等6个品种。

类群II包括黔1103、辽科308和山川907等111个品种，占所有供试材料的50.00%。在遗传相似性系数为0.661 3处，被分成2个亚群，图1中所示分别为亚群IIA、亚群IIB。其中亚群IIA包括黔1103、辽科308和山川907等13个品种；亚群IIB包括强硕68、滇都8号和金禾玉1号等98个品种，占亚群II中测试品种数的88.29%。

类群III包括田玉6号、TY802和罗单20等26个品种，仅占所有供试材料的11.71%。在遗传相似性系数为0.660 8处，被分成2个亚群，图1中所示分别为亚群IIIA、亚群IIIB。其中亚群IIIA仅包括3个品种，分别为田玉6号、TY802和罗单；亚群IIIB包括田玉7号、西抗18和BS07等23个品种。
 

图1 222个玉米新品种的UPGMA树状图 Figure1 UPGMA dendrogram of 222 maize new cultivars

而类群IV只包括明增31、博玉2号和美嘉玉6号等5个品种；类群V只包括2个品种，分别为临玉6号和金州玉2号。由上可知，大量品种集中分布在类群I、类群II中，占测试品种总数的85.14%；亚群IA占类群I中测试品种数的88.46%，亚群IIB占类群II中测试品种总数的88.29%。造成这种现象的原因是品种之间具有共同的亲本或亲缘关系较近的亲本，遗传背景比较单一。

2讨论
目前，我国种子生产和经营管理单位还不太规范，品种引种混乱或品种造假的现象屡有发生，极大地损害了品种权的有者和广大农民的经济利益，因此开展作物品种资源鉴定显得尤为重要(佘花娣等, 2003)。品种纯度检验的传统方法主要包括形态特征、生理特性、同工酶、种子贮藏蛋白等鉴定技术(罗黎明等, 2011)。这些方法需投入大量人力、物力，且检测结果易受环境的影响。为了避免常规技术的局限性，我们采用SSR标记技术构建玉米指纹图谱，利用SSR标记的多样性客观地反映出供试玉米DNA组成上的差异和群体间的遗传多样性，为种子纯度的检测奠定基础。为了保证品种的真实性，所有222个玉米品种均来自云南省区试主管部门和留有备份，以备查对复检。

利用国标推荐的20对引物检测结果表明，有92.79%品种纯度达90%以上，仍有7.21%品种纯度低于90%，这要求育种者高度关注自交系的提纯复壮和制种过程中隔离条件，没有很好的纯度，种子质量难以保证。另一方面，一般情况下，育种者总是希望把自认为纯度高、有生产潜力的品种参加区试鉴定，在自己的多点试验中未发现种子不纯的现象。而SSR技术仍然检测到了16个品种纯度低于90%，这一方面是SSR较为灵敏，另一方面SSR标记不是检测功能基因区域所致。

DNA指纹身份证构建的关键是核心引物。我们选用多态信息量(PIC)、Shannon多样性指数(I)、有效等位基因数(Na)、标记索引数(MI)作为衡量核心引物多态性的指标，实验结果表明所选微卫星标记的多态性存在一定的差异，但均具有较高鉴别效率，适合用于构建222个玉米新品种的DNA指纹图谱。

依据育种者将表型一致的品种进入区试的观点，和各个供试品种一致的主要条带作为品种的特征带，忽略杂带来做聚类分析。UPGMA聚类分析果表明，在遗传相似性系数为0.648 5处，222个供试品种划分为2个大类群和3个小类群。根据24 531个品种对组成的遗传相似度表中(本文未给出)，可以得出遗传相似性系数≤0.600 0的品种对只有3 267个，占品种对总数的13.32%，其中遗传相似系数<0.500 0的品种对只有3个；遗传相似性系数≥0.700 0的品种对有4 163个，占品种对总数的16.97%，其中遗传相似性系数>0.8000的品种对只有31个，而遗传相似性系数>0.900 0的品种对仅有2个；遗传相似性系数位于0.600 0和0.700 0之间的品种对为17 101个，占供试品种对总数的69.71%，表明大部分供试品种之间的遗传相似性系数分布在这个区间内。综上所述，占供试品种对总数的86.68%的品种之间的遗传相似性系数>0.600 0，表明大部分供试品种之间的亲缘关系较近，遗传基础单一化。造成供试品种间遗传多样性较差的主要原因是，由于某些具有优良性状的遗传材料在改良种质过程中的重要作用，使采用这些亲本育成的新品种(跨区域)大幅度增加，造成了生产上同一作物的遗传基础趋于单一化。品种遗传基础单一性的结果不仅降低了品种抗病虫害和抵御不良环境的能力，而且容易在大范围内引发新的病虫害等灾害的发生从而影响玉米生产的稳定性。彭泽斌和刘新芝(1998, 作物杂志, S1: 1-5)报道玉米杂交种的大面积推广使农民种植的品种主要来源于几个自交系。从20世纪80年代中期开始，虽然玉米品种数在不断增长，然而“黄早四”、“Mo17”、“E28”、“丹340”和“自330”等5个骨干自交系对中国玉米生产的遗传贡献率超过了50%，玉米杂交种遗传基础单一的问题已相当严重(李海明等, 2005)。因此构建222个玉米新品种的指纹图谱，可以为玉米多个领域提供丰富的有价值的信息，同时通过对指纹图谱的进一步分析，可以对云南省内玉米品种资源的遗传多样性做出总体评价，从而为云南省的育种工作，品种保护等提供理论依据，并对生产实践有一定提供帮助。

3材料与方法
3.1供试材料
供试品种为2011年云南省玉米区域试验新品种，共222个，分别由云南省种子管理站送样218个，昆明市种子管理站送样4个(表4)。
 

表4 供试222个玉米品种 Table 4 The 222 maize cultivars used in this study

3.2方法
3.2.1 DNA提取
采用赵久然等(2003)的玉米单粒种子DNA快速提取法，提取玉米基因组DNA。

3.2.2 SSR扩增
反应体系：10 µL反应液中包括：1×easy Taq polymerase DNA Buffer (+Mg²⁺)，0.2 mmol/L dNTP，0.25 µmol/L SSR引物(由上海生工生物公司合成)，1单位Taq DNA聚合酶，0.5 µL DNA模板。反应液上加盖15 µL矿物油，防止反应过程中水分蒸发。实验中所使用的20对SSR基本核心引物详细信息，请参见http://www.maizegdb.org/和NY/T1432-2007。

反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，60℃退火35 s，72℃延伸45 s，循环次数30；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR扩增在基因扩增仪WD-9402A (北京六一仪器厂)和L96+(杭州朗基科学仪器有限公司)进行。

3.2.3电泳检测
变性的PCR产物用6.0%PAGE电泳检测。电泳结束后用0.007 5% AgNO₃溶液染色，1.5% NaOH和0.4%甲醛溶液显影，观察结果。

3.3数据统计与分析
采用人工读带的方式，各标记的多态性片段依据分子量从大到小按1、2、3、4、5……进行编号，对于鉴定过程中新发现的多态性片段，按上述规则插入或追加并编号，以1和0分别代表某个基因座相应的等位基因位点扩增DNA条带的有无，9代表缺失带型，记录所有品种等位基因的类型(带型)，并构建(0, 1)的二元数据矩阵，同时转换成基因型矩阵。在记录过程中只记录主要带型、忽略弱杂带型，并注重与标准带型对照和100 bp DNA Marker (TransGen)的比对，同时参考比较鉴定品种之间带型。
种子纯度的计算公式为：种子纯度(%)=(1-(∑_(i=1)^n V_i )/(n×m))×100%

其中，n表示供试的SSR引物总数，m表示某一品种中待测品种总数(本实验中m=5)，Vi表示第i对引物检测到差异位点的品种数目(0=<Vi<=m)。

多态性信息含量(polymorphism information content, PIC)按照Smith等(1997)描述公式计算。该参数是衡量微卫星片段多态性的指标。其计算公式为：PIC=1-∑_(i=1)^n P_i^2

公式中，n为所分析的某个微卫星标记在玉米品种中检测到的多态性片段总数，p_i为第i个等位基因出现的频率。标记索引系数(marker index, MI)按Senior等(1998)提供的公式MI=Allele×PIC计算，Allele为该引物的等位基因数。

利用POPGENE32软件计算Shannon多样性指数(Shannon, 1948) (Shannon's Information index)，等位基因频率(Allele frequency)，有效等位基因数(Effective number of alleles, Kimura and Crow, 1964)，以简单相配系数(Simple matching coefficient, SM)计算品种间的遗传相似系数(genetic similarity, GS) GS=m/(m+n)，其中m表示基因型间共有带数目；n表示基因型间差异带数目。同时，应用软件NTSYSpc 2.10 (Rohlf, 2001)处理数据，按非加权平均数(unweighted pair group method, UPGMA)进行聚类分析，构建222个玉米新品种的聚类图。

作者贡献
吴毅歆是项目的构思者和负责人，指导实验设计，论文写作与修改；刘春明是本实验研究的执行人，负责分子标记实验，参与实验数据整理与分析，论文写作与修改，与第一作者同等贡献；李学进参与样品的采集，实验设计；何月秋、毛自朝是项目的构思者，参与实验设计，试验结果分析和论文修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由云南省支撑计划项目(2006NG19)，云南省农业产业技术体系项目共同资助。作者感谢中国农业科学院烟草研究所任民老师在实验数据统计和转换以及云南农业大学陈卓君、郝昆、胡洲、刘鸿骄、杨珍福、岑爽、武丽娜同学在实验数据获得过程中提供帮助。

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