核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacers, ITS)是位于核糖体18S、5.8S和26S之间转录间隔区的DNA片段，被5.8S分割成2段。由于其进化速率较快、稳定性好、测序方便等特定，已成为研究植物分类和亲缘关系的重要工具(Bellarosa et al., 2005; Kress et al., 2005)。陈少风等(2007)利用ITS序列探讨荻属及其近缘植物的系统发育关系。张利等(2007)基于ITS序列分析仲彬草属植物的亲缘关系，发现形态相似、地理分布一致的物种有聚在一起的倾向，表现出较近的亲缘关系。为了探讨亚洲瓠瓜的地理分化，周先治等(2011)利用ITS序列研究发现，源自日本的瓠瓜品种与源自中国和泰国的品种存在明显的地理分化现象。

冬瓜(Benincasa hispida Cogn.)属于葫芦科(Cucurbitaceae)冬瓜属的一年生蔓性植物，起源于中国南部和印度，广泛分布于亚洲的热带、亚热带和温带地区，是全国性重要蔬菜。冬瓜种质资源丰富，在熟性、瓜形、瓜色、蜡粉、种子形态等方面具有丰富的多态性。对于该属植物系统分类研究，张建军等(2009)根据熟性、果实大小、果形以及RAPD分子标记对100份冬瓜种质资源进行了分类。宋世威等(2010)利用RAPD标记对41份冬瓜和节瓜种质资源进行了遗传多样性分析。目前，国内外尚无关于冬瓜的ITS序列的研究报道。

本研究以冬瓜的41个种质为材料，通过ITS序列来分析冬瓜不同生态种质间的ITS遗传关系，为探讨其系统进化关系提供遗传信息。

1结果与分析
1.1冬瓜的ITS序列分析
本研究共测定了41个冬瓜种质资源的ITS序列。由于所有供试材料的5.8S rDNA的长度均为163 bp，仅有个别碱基的替换，显示出高度的保守性，故不作进一步分析。冬瓜材料的ITS (ITS1+ITS2)长度及GC含量列于表1。从表中可以看出，41个冬瓜材料ITS序列长度变异不大(仅相差3 bp)，且长度变异仅发生在ITS1区(218 bp~221 bp)。供试冬瓜材料内ITS1区GC含量变化范围为59.36%~60.09%，ITS2区为63.36%~64.22%。当空位作为缺失处理时，ITS全长466 bp，共有55个变异位点，其中信息位点5个，占变异位点的9.1%，仅占全长的1.1%。

表1 各材料ITS (包括ITS1和ITS2)长度和GC%含量 Table 1 Sequence sizes and GC content of ITS (ITS1+ITS2) in the tested Wax guards (Benincasa hispida)

1.2冬瓜ITS序列遗传距离及系统树构建
根据Kimura-2参数遗传距离模型，MEGA 5.05软件分析遗传距离，发现不同材料之间ITS的距离在0.000~0.016之间。有些亲缘关系较近的材料，如20 (海南文昌长筒冬瓜)和21 (江苏海安六叶头冬瓜)，因其ITS序列完全一致，故其遗传距离为零。

根据测序结果，以西瓜为外类群，采用邻接法和最大简约法对冬瓜属材料的ITS序列(ITS1+ITS2)构建系统进化树。系统进化树分支上的数字为靴带(bootstrap)重复1 000次抽样检验得出的分支支持率。从图1可以看出，所有冬瓜种质资源主要分在两个分支上。BQ98、B184、B214、B259、B264、P4以及来自云南的部分原始种BN17、BN31、BN32、BN36、BN37为一支，其余材料为另一支，分支支持率均为100%，各分支都有很高的支持率，说明系统树上各组的系统关系可信度较高。邻接树和最大简约树的拓扑结构基本一致(图略)。

图1 邻接法构建的系统进化树 Figure 1 The phylogenetic tree constructed by the Neighbor-joining method

2讨论
我国冬瓜种质资源丰富，主要有一个种和一个变种，在长期的进化过程中，为了适应不同的生态环境而形成遗传分化明显的地理生态类群。冬瓜不同生态类群种质在形态学上表现出极大的差异，目前已用于冬瓜种质资源的分类研究(张建军等, 2009)。然而，形态学分类目前却没有分子系统发育证据的支持。

近年来，利用ITS序列研究植物的亲缘关系和系统分类已成为焦点，已在许多植物上得到广泛应用(史全良等, 2001; 张露等, 2002; 高玉梅等, 2009)。本研究利用ITS序列研究冬瓜属种质资源的系统进化关系，结果发现这些资源主要分为两个分支，且不同生态类群种质资源之间，其ITS序列无明显分化，序列非常保守。该结果表明冬瓜属种质资源虽然经历了长期的自然选择和人工选择，不同来源的种质资源间的ITS序列仍然没有明显的遗传分化。类似结果在其他作物上也有相关报道，张露等(2002)研究新疆石竹属8个野生种的ITS序列时发现，ITS序列在石竹属内相当保守。高玉梅等(2009)以不同地理来源的白菜类作物为材料，发现其ITS序列无明显变异，序列非常保守。

在冬瓜资源研究中，不同地方的冬瓜品种在同一地方、同一条件下种植的田间表现与其在原产地表现出一定的差异。不同生态类群冬瓜资源有着非常相近的遗传背景，其形态学差异可能主要由环境因素造成的。由于ITS序列在部分种类中的分辨率较低，要理清冬瓜属下类群间的亲缘关系，需要结合更多的分子序列和形态性状作进一步研究。

3材料与方法
3.1材料
共选用冬瓜材料41份，均取自广东省农业科学院蔬菜研究所，具体编号及来源见表2。

表2 本实验所用材料 Table 2 The materials used in this study

3.2 DNA提取
取刚展开的幼嫩叶片，采用CTAB法(谢大森等, 2010)提取基因组DNA。

3.3 ITS序列的PCR扩增
ITS全序列(包括ITS1, 5.8S rRNA, ITS2)采用双引物扩增。两引物分别为：5'-CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG-3' (Stanford et al., 2000)；5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' (White et al., 1990)。PCR扩增反应总体积为20 µL，反应体系为：20 ng DNA模板，50 ng正反向引物，2.5 mmol/L的dNTPs，2.5 mmol/L MgCl₂，2 µL 10×PCR buffer和1 U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10min。

3.4目的片段回收及测序
利用琼脂糖凝胶上检测PCR产物，目的片段切下后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(康为世纪)回收。回收产物经纯化后连接于pMD19-T载体(TaKaRa)上，随后加入含有大肠杆菌DH5α感受态细胞的1.5 mL离心管中，37℃静置培养过夜后，挑取单克隆，并在LB液体培养基(含有100 mg/L氨苄青霉素)中振荡过夜。利用菌液PCR方法鉴定阳性克隆。测序由上海英俊生物技术有限公司完成。

3.5序列分析
分析ITS测序结果，确定ITS1、ITS2和5.8S rRNA区，所得序列采用Clustal X 1.83进行排序，用Bio XM 2.6进行GC含量分析，碱基替换的同质性检测用MEGA 5.05 (Tamura et al., 2011)进行。利用MEGA 5.05软件构建邻接树(Neighbor-joining tree)和最大简约树(Maximum parsimony tree)，以自展法(bootstrap)进行检测，共循环1 000次。西瓜(Citrullus lanatus)与冬瓜同属葫芦科，且亲缘关系较近(Kocyan et al., 2007)，因此选该种为外根群进行分析(登录号为FJ915098)。由于ITS1和ITS2的变异都很小，因此聚类分析时把ITS1和ITS2结合在一起计算。

作者贡献
谢大森和江彪是本研究的实验设计和实验研究的执行人；江彪和刘文睿完成数据分析，论文初稿的写作；何晓明参与实验结果分析和论文的修改；彭庆务和赵芹提供实验材料。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
感谢现代农业产业技术体系建设专项(CARS-25-G-36)，广东省科技计划项目(2011A020201002)，广州市科技计划项目(20110000003)给予本试验的经费支持。

参考文献
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