微卫星标记即简单重复序列(Simple sequence repeats, SSR)，是指存在于真核生物体由1~6个碱基对组成的简单重复序列。与RFLP、RAPD、ALFP等其他分子标记相比，微卫星标记具有多态性高、重复性好、准确度高、共显性和符合孟德尔遗传等优点，更适合亲缘关系较近品种的遗传多样性分析(Akagi et al., 1997)。目前，微卫星标记已经广泛应用于基因组作图、群体遗传和进化研究、种质资源多样性分析、杂种优势预测及分子育种等诸多领域(齐永文等,2006, 科学通报, 51(6): 693-699)。

目前，利用SSR标记技术构建水稻指纹图谱(肖小余等, 2006; 陈英华等, 2009; 从夕汉等, 2010)、构建水稻的指纹数据库(庄杰云等, 2006; 程本义等, 2007)、进行遗传多样性分析(应杰政等, 2007; 甘晓燕等, 2009; 刘传光和张桂权, 2010)和品种鉴定(樊叶杨等, 2000; 施勇烽等, 2005)等研究的报道很多。在前人工作基础上，本研究采用中国水稻所推荐的12对首选SSR引物(庄杰云等, 2006)分析水稻品种的种子纯度，构建了134个水稻新品种的DNA指纹图谱，分析其遗传多样性，为云南省水稻新品种登记注册、品种真实性、纯度鉴定、知识产权保护、遗传资源评价及亲缘关系分析提供理论依据和技术支持。

1结果与分析
1.1 SSR标记的多态性
134个水稻品种在12对多态性位点上共检测到55个等位基因数(表1)，平均每个标记4.583 3个，变幅2~7个，其中引物RM336多态性最高，在供试品种中共检测到7个多态性片段，引物RM297次之，分别检测到6个多态性条带，但引物RM311多态性差，只在供试品种中检测到2个多态性条带，引物RM274多态性较差，只在供试品种中检测到3个多态性条带。按照不同类型看，籼稻组和粳稻组检测到的多态性条带数差异明显，其中籼稻组共检测到55个多态性条带，粳稻组共检测到43多态性条带。12个微卫星标记检测到的等位基因数大致呈梯形分布。

 

表1 SSR标记的等位基因数和有效等位基因数 Table 1 Number of alleles and number of effective alleles for SSR markers

 
 

12个微卫星标记有效等位基因总数为33.398 0个(表1)，平均每个标记4.257 5个，变幅1.342 0~3.771 9个，其中引物RM190的有效等位基因数最多，为3.771 9个，而引物RM85的有效等位基因总数最少，为1.342 0个。分类型看，籼稻组和粳稻组的有效等位基因数差异不大，籼稻组的有效等位基因数位32.901 1，粳稻组的有效等位基因数位29.863 4。12个微卫星标记的有效等位基因数大致呈梯形分布。籼稻组在每个首选标记上检测到的等位基因数和134个水稻品种检测到的有效等位基因数一致，但籼稻组和水稻品种总数之间的有效等位基因数存在一定差异。

1.2品种的遗传多样性水平分析
用Shannon多样性指数(I)、多态性信息含量(PIC)来衡量水稻品种的遗传多样性水平(表2)，Shannon多样性指数平均值1.133 6，变化幅度0.537 8~1.502 2；PIC平均值为0.605 5，变动范围0.254 8~0.734 9。其中引物RM85的Shannon多样性指数和PIC值最小，分别为0.537 8和0.254 8，引物RM297的Shannon多样性指数最大，为1.502 2，引物RM190的PIC值最大，为0.734 9。

 

表2 12对SSR标记在不同类型水稻品种中的Shannon多样性指数和多态性信息含量 Table 2 Shannon's Information index and polymorphism information content at 12 SSR loci in different types of rice cultivars

 

按照不同类型看，籼稻组和粳稻组的Shannon多样性指数(I)、多态性信息含量(PIC)总数差异不大(表2)，而籼稻组和粳稻组只在少数位点上的Shannon多样性指数和多态性信息含量差异较大，如籼稻组中RM219的I值为1.310 4，PIC值为0.676 8，而粳稻组RM219的I值为0.500 4，PIC值为0.320 0。

由表3可知，各标记的等位基因在134个水稻品种中的出现频率差异很大，依据基因频率的不同可将其分成主导、一般和稀有三类等位基因，如RM297标记的6，5和3号等位基因。进一步分析发现，籼型与粳型的等位基因频率分布差异明显，如籼稻RM85标记的1，3和4号等位基因频率分别为，0.919 4，0.004 0和0.012 1，而粳稻的RM85标记的1，3和4号等位基因频率分别为，0.100 0，0.800 0和0。

1.3水稻新品种纯度分析
134个水稻新品种的种子纯度测定结果见表4。这些水稻品种的种子纯度都分布在80.00%及以上，其中128个水稻品种的种子纯度90.00%，占所有品种数的95.52%；其中有113个水稻品种的种子纯度95.00%，占供试品种总数的84.33%，但仍有1个品种的纯度仅为80.00%。
 

表3 12个SSR位点在134个水稻品种中的等位基因频率 able 3 Frequency of alleles at 12 SSR loci in different types of 134 rice cultivars

1.4品种亲缘关系聚类分析
根据扩增产物在聚丙烯酰胺电泳凝胶上的相对位置，并参照100 bp DNA Marker条带位置，确定不同的谱带类型，并按扩增片段从大到小的顺序编号，按照0、1、9统计SSR扩增产物，组成134个水稻新品种的二元数据矩阵，构成134个水稻品种的数字化指纹图谱。

类群Ⅰ包括竹优1013、武香9号和广优1186等115个品种，占所有测试品种总数的85.82%。在遗传相似性系数为0.6058处，类群I被进一步分为两个亚群，如图1所示，分别为亚群IA、亚群IB，其中亚群IA包括竹优1013、武香9号和广优1186等50个品种，占测试品种总数的43.48%；亚群IB包括内2优11，莲优852和内2优3号等65个品种，占测试品种总数的56.52%。
 

表4 134个水稻品种种子纯度分布表 Table 4 The seed purity of 134 rice new cultivars

类群Ⅱ仅包括2个品种，分别为Y两优9988、Y两优342，占所有测试品种总数的1.49%。类群Ⅲ只包括4个品种，分别为千乡优416、珍优17、XF优2399和宜香2516，占所有测试品种总数的2.99%，类群Ⅳ和Ⅴ都只包括1个品种，分别为皖稻131和滇杂49，分别占所有测试品种总数的0.75%，类群Ⅵ也包括2个品种，分别为明两优863、2002-11，占所有测试品种总数的1.49%，类群Ⅶ包括5个品种，分别为滇优37、滇优38、滇杂43、滇杂47和滇杂44，占所有测试品种总数的3.73%，类群Ⅷ也包括4个品种，分别为保粳杂2号、滇杂701、滇杂42和两优5519，占所有测试品种总数的2.99%。

进一步观察，发现类群Ⅶ和Ⅷ包括9个水稻品种全为粳稻，而余下的1个粳稻品种—滇杂49则被归在类群Ⅴ中。进一步分析遗传相似性表，这10个粳稻品种之间的平均遗传相似性系数为0.544 2，滇杂42和滇杂701的遗传相似性系数最大，为0.838 7，滇杂49和滇优38的遗传相似性系数最小，为0.315 8。说明10个粳稻品种间的遗传背景差异比较大。

综上所述，大量品种集中分布在某类群中，如类群Ⅰ包括品种数占测试品种总数的85.82%；而而类群Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ共包括19个品种，仅占测试品种总数14.18%。造成这种现象的原因很多，如品种之间具有共同的亲本或亲缘关系较近的亲本，其生长环境相似等。

2讨论
2.1 SSR引物的多态性
等位基因数(Na)和多态性信息含量(PIC)用来衡量分子标记的多态性的重要指标。由表1和表2可知，这两个指标并不完全一致，如引物RM336的检测到等位基因数最多，但多态性信息含量为0.696 6，并不是PIC值为最大的引物，PIC值最大的引物为RM190，为0.734 9。按照水稻分型来看，虽然引物RM336在籼稻和粳稻检测到等位基因数最多，分别为7个和5个，但是籼稻中多态性信息含量最高的引物是RM190，值为0.745 8，而粳型稻中引物RM19的多态性信息含量最高，为0.740 0。尽管这两个指标并不能一致地反应引物的多态性，但是它们在一定程度上能反应SSR标记的多态性。

2.2种子的纯度
目前，我国种子生产和经营管理单位还不太规范，品种引种混乱或品种造假的现象屡有发生，极大地损害了品种权的有者和广大农民的经济利益，因此开展作物品种资源鉴定显得尤为重要(佘花娣等, 2003)。水稻杂交种子纯度鉴定包括田间小区种植检验，生理生化特性鉴定技术，前者多采用异地鉴定，费时费力，后者采用的生理生化指标存在组织特异性强、多态性较少等限制因素(谭智丹等, 2006)。为了避免常规技术的局限性，我们采用SSR标记技术构建水稻指纹图谱，利用SSR标记的多样性客观地反映出供试水稻DNA组成上的差异和群体间的遗传多样性，为种子纯度的检测奠定基础。为了保证品种的真实性，所有134个水稻品种均来自云南省区试主管部门和留有备份，以备查对复检。

利用国标推荐的12对引物检测结果表明，有95.52%品种纯度达90%以上，仍有1个品种纯度仅为80%，这要求育种者高度关注自交系的提纯复壮和制种过程中隔离条件，没有很好的纯度，种子质量难以保证。另一方面，一般情况下，育种者总是希望把自认为纯度高、有生产潜力的品种参加区试鉴定，在自己的多点试验中未发现种子不纯的现象。而SSR技术仍然检测到了6个品种纯度低于90%，这一方面是SSR较为灵敏，另一方面SSR标记不是检测功能基因区域所致。

 

图1 134个水稻新品种的UPGMA树状图 Figure 1 UPGMA dendrogram of 134 rice new cultivars

2.3品种的遗传多样性
UPGMA聚类分析果表明，在遗传相似性系数为0.560 4处，134个供试品种划分为1个大类群和7个小类群。根据8 911个品种对组成的遗传相似度表中(本文未给出)，可以得出遗传相似性系数<0.500 0的品种对只有1 747个，占品种对总数的19.60%，其中遗传相似系数<0.300 0的品种对只有50个；遗传相似性系数>0.700 0的品种对有1 568个，占品种对总数的17.60%，其中遗传相似性系数>0.900 0的品种对只有21个，而其中有4个品种对之间的遗传相似性系数>0.960 0；遗传相似性系数位于0.500 0和0.600 0之间的品种对为2 448个，占供试品种对总数的27.47%，遗传相似性系数0.600 0和小于0.700 0的品种对为2 681个，占供试品种对总数的30.09%，表明大部分供试品种之间的遗传相似性系数分布在这个区间内。综上所述，占供试品种对总数的77.06%的品种之间的遗传相似性系数大于0.500 0，表明大部分供试品种之间的亲缘关系较近，遗传基础较单一。

进一步分析图1，发现中优系列(包括5品种)、冈系列(包括5个品种)和Ⅱ优系列(包括4个品种)分布亚群IA中，结合中国水稻品种及其系谱数据库(http://www.ricedata.cn)和中国杂交水稻品种资源数据库(http://www.hybridrice.com.cn/)的品种来源信息分析，表明这三个系列内各个品种间的母本来源相似，其中富优4号因和II优系列具有相同的母本(Ⅱ-32A)，也被聚在亚群IA中。另外，内系列品种(包括13个品种)也因具有相同遗传基础而分布在亚群IB中。说明相同的不育系或恢复系因其很好的广义配合力等优良的性状，而被不同育种者或单位所引用，结果使采用这些亲本育成的新品种(跨区域)大幅度增加，造成了生产上同一作物的遗传基础趋于单一化。品种遗传基础单一性的结果不仅降低了品种抗病虫害和抵御不良环境的能力，而且容易在大范围内引发新的病虫害等灾害的发生从而影响水稻生产的稳定性。因此构建134个水稻新品种的指纹图谱，分析其遗传多样性对云南省的水稻品种的育种工作，品种保护和水稻生产实践有重要的指导作用。

3材料与方法
3.1供试材料
供试品种为2011年云南水稻新品种，共134个，由云南省种子管理站和云南农大稻作所等单位送样(表5)。其中10个品种为粳稻，分别是滇优37、滇优38、滇杂42、滇杂43、滇杂44、滇杂47、滇杂49、滇杂701、两优5519、保粳杂2号，剩余124个品种，全为籼稻。

3.2方法
3.2.1 DNA提取
每份材料分别取2~3片新鲜幼嫩的叶片，用CTAB法(Murray and Thompson, 1980)提取水稻基因组DNA。
 

表5 134个水稻品种编号、名称 Table 5 Codes and names of 134 new rice cultivars used in this study

3.2.2 SSR扩增
反应体系：10 µL反应液中包括：1×easy taq polymerase DNA buffer (+Mg²⁺)，0.2 mmol/L dNTP，0.25 µmol/L SSR引物(由上海生工生物公司合成)，1单位Taq DNA聚合酶，0.5 µl DNA模板。反应液上加盖15 µL矿物油，防止反应过程中水分蒸发。实验中所使用的12对SSR基本核心引物信息，请参见http://www.gramene.org 和NY/T1433-2007。

反应程序参照NY/T1433-2007。PCR扩增在基因扩增仪WD-9402A(北京六一仪器厂)和L96+(杭州朗基科学仪器有限公司)进行。

3.2.3电泳检测
扩增产物在6.0%聚丙烯酰胺凝胶上分离。电泳结束后用0.007 5% AgNO₃溶液染色，1.5%NaOH和0.4%甲醛溶液显影，观察结果。

3.3数据统计与分析
采用人工读带的方式，同时参照程本义等(2007)的读带方式，按照分子量的大小对各标记的多态性片段编号，对于统计过程中新发现的多态性片段，按上述规则插入或追加并编号，以1和0分别代表某个基因座相应的等位基因位点扩增DNA条带的有无，9代表缺失带型，记录所有品种等位基因的类型(带型)，并构建(0, 1)的数据矩阵，然后转换为基因型矩阵。

种子纯度的计算公式为

公式1

 
其中，n表示供试的SSR引物总数，m表示同一品种中待测模板总数(本实验中m=5)，Vi表示第i对引物检测到差异位点的模板总数(0≤Vi≤m)。

多态性信息含量 (polymorphism information content, PIC)按照Smith等(1997)描述公式计算。该参数是衡量微卫星片段多态性的指标。其计算公式为

公式2

 

式中，n为所分析的某个微卫星标记在水稻品种中检测到的多态性片段总数，pi为第i个等位基因出现的频率。利用POPGENE32软件计算Shannon多样性指数(Shannon, 1948) (Shannon's Information index)，等位基因频率(Allele Frequency)，有效等位基因数(Kimura and Crow, 1964) (Effective number of alleles)。同时，应用软件
NTSYSpc2.10处理数据，利用DICE参数计算水稻品种间的遗传相似系数(Genetic similarity, GS)，并按非加权平均数(unweighted pair group method, UPGMA)进行聚类分析，构建134个水稻新品种的聚类图。

作者贡献
吴毅歆是项目的构思者和负责人，指导实验设计，论文写作与修改；刘春明是本实验研究的执行人，负责分子标记实验，参与实验数据整理与分析，论文写作与修改，与第一作者同等贡献；李学进参与样品的采集，实验设计；何月秋、毛自朝是项目的构思者，参与实验设计，试验结果分析和论文修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由农业部公益性行业(农业)科研专项(201203014)资助。作者感谢中国水稻研究所庄杰云老师在实验数据统计以及云南农业大学郭力维、尹海霞、张照然同学在实验数据获得过程中提供帮助。

参考文献
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