薰衣草属(Lavandula L.)，分布于大西洋群岛及地中海地区至索马里，巴基斯坦及印度；我国原先引进栽培的仅2种，即狭叶薰衣草(Lavandula angustifolia Mill)、又称真薰衣草，和宽叶薰衣草(Lavandula latifolia Vill)，现在又逐渐从国外引进了羽叶薰衣草(Lavandula pinnat)、齿叶薰衣草(Lavandula dentate)和新疆薰衣草(Lavandula vera)，亦可音译为“维拉薰衣草”等多个品种(刘方农等, 2007, 芳香植物鉴赏与栽培, 上海科学技术文献出版社, pp.312-314; 王羽梅, 主编, 2008, 中国芳香植物, 科学出版社, pp.218-221)。

薰衣草是典型的全草香型香草，其全草可提炼薰衣草油(富含酚, 醇类等物质)，其功能多、用途广，常被用于医药、食品、保健、化妆品工业，尤其在药用方面既可治疗身体疾病，又可治疗心理不适(Al-Amier et al., 1999)。在身体疾病治疗方面，具有抗细菌、抗真菌、镇痛的作用，还可治昆虫叮咬和烧伤等；对心理不适治疗方面，具有镇静、安神、缓解压力的作用(Cavanagh and Wilkinson, 2002)。

近年来，国外研究者已陆续开展临床研究：Denner提出薰衣草提取物除了传统疗效外，还对退行性炎症、传染性疾病和肿瘤具有抑制作用(Denner, 2009)；Vakilian等研究发现，薰衣草精油对妇产科常见的阴部伤口有较好疗效，同一些外阴切开术的常用药相比，具有健康、无毒、香薰的疗效(Vakilian et al., 2011; Jones, 2011)；Altaei以实验兔子的口腔溃疡疾病为对象，利用薰衣草精油和安慰剂作对照给药，研究结果显示薰衣草精油对口腔溃疡有显著疗效(Altaei, 2012)。另外，薰衣草提取物中含有重要的非酶类抗氧化剂—迷迭香酸(Georgiev et al., 2009)，具有抗氧化和抗产多巴胺细胞中神经毒素相关疾病，如神经细胞中因过氧化氢引起的细胞死亡或其他的氧化伤害等(Lee et al., 2008)。因此，薰衣草精油及其它提取物具有安神、镇静、缓解压力的疗效(Kovacheva et al., 2006)。

维拉薰衣草(L. vera)精油含量高，也是经济价值好的熏衣草，叶狭长绿色，花呈穗状，淡紫色，全株有浓郁的芳香(http://baike.baidu.com/view/1445818.htm)，也是重要的蜜源植物。除了具有化妆品、保健功能、药用功能、食用功能外，其花型优美典雅，其蓝紫色穗状轮生花序颖长秀丽、全草散发浓郁的芳香气味，不仅为庭院中一种多年生耐寒、耐旱花卉，同时也适宜户外大面积种植成旅游观光园(林沛林等, 2008, 北海道薰衣草的繁殖与栽培, 安徽科技通讯, 8: 188)。目前，国际上正在兴起一种“芳香主题旅游”。如法国、日本采用“花境”形式经营芳香植物农场，每年都吸引大批游客。国外还有以薰衣草为主题的植物园、芳香医院等。此外，还可以将薰衣草深加工成干花、香囊、香枕等旅游纪念品(吴卓珈, 2005, 生态农林新产业：芳香植物, 今日科技, 6: 11-13)。近年来在国内也有大面积种植薰衣草为主题的农庄园，兴起了时尚度假游或者婚庆典礼等薰衣草主题旅游庄园(如北京蓝调薰衣草庄园)。

随着薰衣草用途的逐步广为人知，其需求量也与日俱增，传统的繁殖方式已成为制约薰衣草产业发展的重要因素。目前薰衣草的传统繁殖方法有：1、种子繁殖，但不易萌发，由于薰衣草是异花授粉植物而不易保持优良品种的特性，种子后代容易分化。2、无性繁殖，采用嫩枝或半木质的枝条进行扦插、压条或分株繁殖等，缺点是植株容易衰老，而且扦插时老枝不易生根，嫩枝易腐烂(江明等, 2009; 王佳佳等, 2010)。因此，采用离体快繁(许耀祖等, 2005)，可以保持优良品种的种性。而本研究以薰衣草叶片为外植体、探索简单有效的愈伤组织诱导及再分化体系，此体系的建立可有3个用途：1、可直接为大田栽培快速提供性状一致的种苗；2、可为转基因研究奠定基础；3、可为悬浮细胞培养奠定基础，如薰衣草悬浮细胞培养生产迷迭香酸，通过各种条件，如营养条件、生物反应器条件等优化研究，以获得特定条件下、稳定的迷迭香酸高产细胞株(Pavlov et al., 2000; 2005; Georgiev et al., 2006)。

另外，笔者认为，在植物离体培养、快繁时，单凭“诱导率”、“再生率”、“生根率”和“高频再生体系”等不足以完全表达培养材料在适合培养基中的生命质量和生活状态，除以上各频率描述外，结果中应呈现更多的、培养材料生长相关信息的描述。

1结果与分析
1.1维拉薰衣草叶片脱分化形成愈伤组织
接种后4~6 d，叶片边缘开始卷曲上翻，7 d左右自边缘处开始膨大长出乳白色至浅黄色愈伤组织，25~30 d，接种的叶片已经完全失去原有的形态特征，愈伤组织诱导率因培养基所加生长调节剂浓度不同而异，其中MS+2,4-D 2 mg/L+KT 0.5 mg/L 培养基愈伤组织诱导率最高，达100% (表1)。同已有报道不一样，所获愈伤组织不是质地致密、绿色或浅绿色，而是乳白色至浅黄色质地疏松的愈伤组织。
 

表1维拉薰衣草叶片愈伤组织诱导培养 Table 1 Callus induction of L. vera leaves

1.2维拉薰衣草愈伤组织再分化培养
愈伤组织接种到不同的分化培养基上(图1 A)，7 d后有绿色的芽点从愈伤组织表面分化而成，培养至25~30 d后，不定芽形成。愈伤组织在分化成不定芽的同时，会继续生长膨大，颜色逐渐变深，甚至褐化。一旦生长调节剂浓度不适合，愈伤组织褐化程度增加，玻璃化不定芽增多，或无效不定芽增多，再分化频率降低。本研究发现，MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L处理中再生频率最高，可达85% (表2)，愈伤组织较少褐化，平均芽长最大、形成的有效不定芽数也最多，每块平均有效不定芽有5~10个(图1 D)，以85%的再生频率计，每块愈伤组织再生10个不定芽，则接种100块愈伤组织可再生850个不定芽；而有的处理，愈伤组织分化频率也可达50~75%之间(图1 B, C)，但每块愈伤组织上的有效不定芽(即具有完整的主茎的不定芽)只有有1~2个，以75%的再生频率计，每块愈伤组织最多再生2个有效不定芽，则接种100块愈伤组织可再生150个有效不定芽。由此可知，处理间对培养材料的效应不只是简单的(85%~75%=) 10%的差异，而是((850~150)/150=) 4.7倍的差异。以此类推，再分别以150、850个有效不定芽来扩繁增殖，出现更大几何级数的差异皆有可能。
 

图1维拉薰衣草愈伤组织再分化情况 Figure 1 Regeneration of callus of L. vera

表2维拉薰衣草愈伤组织再分化培养 Table 2 Regeneration of callus of leave explants (L. vera)

1.3维拉薰衣草不定芽增殖培养
愈伤组织再分化培养基中，生长调节剂减量后即可诱导不定芽增殖，在所有的增殖培养基中，诱导不定芽增殖的同时，均会在底部形成或多或少的愈伤组织(图2 A)。表3中所有处理均可诱导不定芽增殖，只是，有的处理虽然增殖频率也较高，但有效芽数较少，往往由底部的愈伤组织处增殖出很多矮于1 cm的不定芽(图2 B)。而处理7, MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L增殖频率最高(556%)，且有效芽数也最多，芽长也最大(图2 C, D)。

图2不定芽增殖状态 Figure 2 Adventitious buds proliferating in different status

表3不定芽增殖培养 Table 3 Proliferation of adventitious buds

1.4诱导生根培养
诱导不定芽再生和增殖的培养基均抑制根的生长，当获得足够多的不定芽后，将不定芽丛于超净台上作单芽分开(见图2 D)，接种于诱导生根的培养基上。本研究发现，当MS培养基中添加入诱导生根的植物生长调节剂时，不定芽基部易产生愈伤组织，而长愈伤不定芽生根培养中的一大忌。因此，不添加任何生长调节剂的MS培养基或1/2 MS培养基生根培养时，均不诱导愈伤组织在根部生成，而MS培养基中诱导的平均根数较多、根长较长。

图3维拉薰衣草生根 Figure 3 Rooting induction of plantlet of Lavender (L. vera)

2讨论
本研究选择精油含量高，经济价值好的薰衣草品种维拉进行快繁研究。其主要目的主要有三个，第一，快繁此优良品种；第二，为转基因体系建立高频而有效的再生体系；第三，为后期利用悬浮细胞培养生产有用此生代谢产物奠定基础，例如从悬浮细胞提取迷迭香酸是目前的研究热点(Pavlov et al., 2000; 2005; Georgiev et al., 2006; 2009; Kovacheva et al., 2006)。

前人有报道建立薰衣草的高频再生体系，但本研究发现，在判断培养基对培养材料的目标产物是否高效和有效时，除单纯地用诱导率、再生频率、增殖频率、生根率以及高频再生体系等描述是不准确和全面的。因为，如果诱导出来的愈伤组织不能高效分泌有用次生代谢产物，或者不能有效地再分化为不定芽，仅一味地追求高诱导率和再生频率是不科学的。同理，尽管有时生根率较高，但在根和芽之间形成了阻碍维管束连通的愈伤组织，则移栽难以成活，这样的根也是无效根。因此在植物离体再生体系建立时，单凭“诱导率”、“再生率”、“生根率”和“高频再生体系”等不足以全面描述培养基条件的适合度，还应综合考虑培养材料的生长状况。

本研究发现，维拉薰衣草不定芽在培养基中培养时间较长时，培养基中有蓝色分泌物出现，使原本无色的培养基变成蓝色(图2 A)，该物质是什么、为何会产生以及有何用途有待进一步研究。

3材料与方法
3.1实验材料
维拉薰衣草(L. vera)幼嫩叶片，由刘雅婷教授引种至云南农业大学农学与生物技术学院温室栽培；基本培养基为MS (Murashige and Skoog, 1962)固化培养基，每升添加蔗糖30 g、琼脂7 g，pH为5.8，添加不同浓度植物生长调节剂(NAA, KT, 6-BA)；培养基于0.1~0.15 kPa气压下，121℃灭菌20 min备用；无菌水(自来水高温高压灭菌)，75%乙醇，0.15%升汞。

3.2维拉薰衣草(L. vera)叶片愈伤组织诱导
挑选生长健壮无病害的薰衣草嫩枝4 cm左右，用自来水流水冲洗0.5~1 h，用75%乙醇灭菌40 S，用0.15%升汞灭菌5~7 min，再用无菌水冲洗3~5遍，于灭菌的培养皿(垫无菌滤纸)将嫩叶切成0.5~0.8 cm大小的叶盘接种，培养。温度(23±2)℃，相对湿度75~85%，光照强度2 500 L x，光照/黑暗时间为12 h/12 h。从5~7 d开始观察并统计污染率和是否启动愈伤组织脱分化，后每隔10 d左右观察记录材料生长情况(表1)。

3.3维拉薰衣草(L. vera)不定芽诱导培养
当愈伤组织生长到完全失去叶片的形态结构，并膨大至1.5~2.5 cm²时，一部分在原配方培养基上对其进行继代增殖培养，另一部分提高培养基中细胞分裂素类/生长素类的浓度比率，诱导其再分化成不定芽，7 d，后每10 d观察记录结果(表2)。除再分化频率外，本研究还记录了不定芽再分化时的一些关键生长信息(表2)。

3.4维拉熏衣草(L. vera)不定芽的增殖培养
再分化形成的薰衣草不定芽还需增殖，才能以几何级数增殖、达到快繁的目的。在此，不能单一追求高的增殖频率，还要注意观察增殖的芽是否都有主茎，适于单芽分开用于再增殖或诱导生根。故，除增殖频率，本研究还记录了不定芽增殖的一些关键生长信息(表3)。

3.5维拉薰衣草(L. vera)不定芽生根培养及完整植株形成
当芽增殖到一定数量时，即可进行生根诱导。在培养皿中切分芽丛，选取长度为2~5 cm的单芽进行生根培养。15 d后观察生根结果。有的芽不能生根，有的芽能生较而粗短的根，且在根部和茎基部连接处有愈伤组织，有的则无愈伤组织，并可清晰看见根和茎连通生长(表4, 图3)。当根生长到5±2条、长度为3~6 cm时，即可揭开瓶盖或封口膜，先加入浅层的自来水以保证瓶内相对湿度，置于培养室中。5~7 d后，将植株取出，洗净根部的培养基，用镊子稍用力拉扯小植株再生根，少部分根易脱落，多数根与茎连接紧密不易脱落，选择根未脱落的小植株移栽入基质，1/10 MS (有机物除外)作为营养液浇灌植株后，用塑料膜保湿5~7 d后完全置于自然环境中，可大大提高薰衣草组培苗成活率。

表4不定芽生根培养基筛选 Table 4 Choice of medium used for rooting of buds

作者贡献
董玉梅和段如兰是本研究的方案设计和直接实施者，共同完成实验数据整理分析及论文初稿。李正楠、王曼君和尹兴福共同参与了预备前期研究、后期资源保存和扩繁工作；刘雅婷修改论文定稿。全体作者都阅读并同意最终文本。

致谢
本研究受云南省教育厅科学研究基金项目(项目编号: 2011Y441)、经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室开放基金(项目编号: 20011BLKF244)共同资助。感谢云南农业大学农学院实验中心提供开放的实验平台。感谢匿名的同行评审人的评审建议和修改建议。

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