据统计，全球粮食与饲料作物总产量每年因虫害造成的损失达14%，直接给农业生产造成的经济损失高达数千亿美元。同翅目害虫蚜虫、稻飞虱和叶蝉等对农业生产造成的危害是严重的，在直接引起作物的产量损失和品质下降的同时，还将多种致病病原菌和病毒传播给植物，加重危害程度。在植物抗虫育种研究中，应用植物外源凝集素基因转基因技术获得抗虫特性近年来研究较多。在体外或转基因抗虫实验中应用最多的是雪花莲外源凝集素(GNA)，研究结果显示对烟草夜蛾、豌豆象、飞虱和蚜虫等咀嚼式和刺吸式口器昆虫均有抗性。

半夏(Pinellia ternata Schott)为天南星科半夏属植物。凝集素是半夏蛋白的重要组分之一，能专一结合甘露糖，属于单子叶植物甘露糖凝集素家族(孙册等, 1983; 王克夷和郭锰, 1993)。研究结果显示，人工饲喂半夏凝集素提取物的量达到1.2 g/L时，对棉蚜发育有明显的抑制作用；当人工饲喂半夏凝集素提取物的量达到1.5 g/L时，对桃蚜发育有明显的抑制作用(黄大昉等, 1997)。

国内部分实验室应用半夏凝集素基因(pta)在水稻(张红宇等, 2003)及百合(唐东芹等, 2004)、菘蓝(许铁峰等, 2003)等植物上开展了转基因研究，获得了一些转基因工程植株，显示出良好的抗虫性能和应用前景。

甘肃西和半夏是半夏之精品，享有盛誉。本研究克隆了甘肃西和半夏凝集素完整基因，通过花粉管通道法开展了棉花转基因研究，旨在建立棉花转基因方法和培育抗虫种质。

1结果与分析
1.1半夏凝集素基因(pta)扩增
扩增模板DNA为提取纯化的半夏叶片基因组DNA，特异引物为pta-F、pta-R，通过PCR扩增获得目的基因片段长度约1 000 bp ，长度与实验设计预期结果一致(图1)。

图1 PCR扩增半夏DNA片段 Figure 1 DNA fragment of Pinellia ternate amplified by PCR

1.2目的基因的克隆与鉴定
按照回收试剂盒说明，纯化回收PCR扩增产物，将其连接到pGEM-T载体上，转化大肠杆菌DH5α。少量提取重组质粒用XbaⅠ和SmaⅠ双酶切及PCR进行鉴定(图2)，结果都出现了大约1 000 bp的序列片段，其长度与扩增片段相符。证明pGEM-T载体构建是正确的(图2)。

图2 pGEM-T-pta重组质粒PCR及酶切鉴定 Figure 2 Identification of pGEM-T-pta by PCR and Enzymetic digestion

1.3半夏凝集素基因(pta)序列及其编码氨基酸分析
pta序列测定结果表明(图3)，扩增片段全长为1 069 bp，应用DNAMAN 6.0对序列进行分析，在序列的29~835 nt处发现一连续ORF，第29~31 nt处是该序列的转录起始密码子ATG，833~835 nt为终止密码子，全编码区为804 bp，编码一条268个氨基酸残基的多肽，预测分子量29.1 kD，等电点为7.77。5'端非编码区(5'UTR) 28 bp，3'端非编码区(3'UTR) 234 bp。在poly(A)上游存在典型的真核生物基因poly(A)的信号序列-AATAAA。第27~120位氨基酸残基、第144~177位氨基酸残基分别为两个保守结构域，第1个结构域含1个甘露糖结合位点，第2个结构域含2个甘露糖结合位点，具有甘露糖结合植物凝集素的典型特征(Lin et al., 2006)；分析pta编码蛋白N-末端序列，发现序列中N-端有21个氨基酸残基的信号肽，剪切位点位于第24位的丙氨酸(A24)和第25位的缬氨酸(V25)之间；前端33个氨基酸和中间区域第118~155位的37个氨基酸残基主要是由一些疏水性氨基酸组成的肽链，其余区域以亲水性氨基酸组成，从整体来看，pta在一级结构上以亲水性为主。pta已在GenBank/EMBL中登记，登录号AY725425。与已报道的同科PTA基因核苷酸序列比对分析显示，该基因序列也有相似的保守序列域和QXDXNXVXY(QDNVY)甘露糖结合识别区，因而推测也应具有相同的抗虫功能。

图3 表达载体pBI-pta结构简图 Figure 3 The scheme of plasmid pBI-pta

1.4表达载体pBI-pta的构建与鉴定
用XbaⅠ和SmaⅠ限制性内切酶对质粒pGEM-pta进行酶切，回收1 069 bp的目标片段。用XbaⅠ和SmaⅠ限制性内切酶消化pBI121质粒后，补平经SmaⅠ粘端，然后将回收的pta基因通过粘端(XbaⅠ)-粘端(XbaⅠ)、平端(SmaⅠ)-平端(SmaⅠ)连接，得到由CaMV 35S启动子驱动的pta基因的植物表达载体pBI-pta (图3)，导入E. coli DH5α。进行酶切和PCR，均得到一条1 069 bp目标片段，说明pBI-pta植物表达载体的构建是正确的，可以用于基因转化研究。

1.5转基因棉花植株及其后代的抗性筛选和分子鉴定
以陇棉2号为受体材料，做2 000个导入处理，收获T₀棉铃共130个，导入材料成铃率为6.5%。

将T₀棉铃种子按单粒种植，经卡那霉素筛选获得T₁抗性植株5株，单株收获并进行室内考种。抗性植株与对照田间调查和室内考种发现，两者在植株形态与经济性状上无明显差别。

用2 500 mg/L卡那霉素连续涂抹棉花第一片真叶7 d后，对照及导入材料仅有个别植株(<5%)有叶片变薄、变大和发黄症状；4 000 mg/L卡那霉素涂抹5~7 d后，约有50%以上植株叶片明显黄化或出现黄色斑点；6 000 mg/L卡那霉素涂抹3~6 d后，约50%~96%植株黄化(图4)。在后续转基因棉花的筛选中直接选用了6 000 mg/L卡那霉素作为筛选浓度、筛选周期为6 d，每批转基因材料筛选周期缩短约14 d。

图4 6 000 mg/L卡那霉素筛选转化棉花 Figure 4 Transgenic cotton identified by kanamycin selection with 6 000 mg/L

T₂植株中，23株卡那霉素6 000 mg/L的黄化植株PCR扩增没有出现pta和nptⅡ目的条带；14株抗性植株中有6株扩增出了nptⅡ的目的条带(图5)，但都没有扩增出pta基因。PCR分子鉴定结果初步表明，外源nptⅡ已整合到棉花的基因组中。

图5 棉花抗性植株nptⅡ扩增结果 Figure 5 nptⅡ amplification of cotton resistant plants

2讨论
在早先的实验中，证明所克隆的半夏凝集素基因具有较好的抑制蚜虫效果，转基因烟草植株的蚜口密度抑制率在25.5%~89.4%，平均蚜口密度抑制率为56.2% (张正英等, 2010)。本研究通过花粉管通道法将半夏凝集素基因直接转入棉花品种陇棉2号中，通过抗性筛选和PCR分析证明获得了转基因后代。对T₁抗性植株在伏蚜期田间调查单株蚜量，以棉株顶部5叶中受害叶最重叶片为标准叶，结果初步显示抗性植株对棉蚜表现中抗水平，抗性植株蚜害减退率较对照高10%。抗虫性是否稳定表达，需要继续验证。

花粉管通道法操作简单，转化成本较低，为农作物育种提供了创造新种质的新途径。多数利用花粉管通道法获得转化棉花后代的研究报告，提供了分子生物学证据(翁坚等, 1984; 郭三堆等, 1999; 邓德旺等, 1999)。但是，转化后代假阳性植株多，鉴定工作量大，总体转化效率低(周小云等, 2008, 生物技术, 18(2): 93-95)。本研究从6 000 mg/L卡那霉素抗性植株中检测出了报告基因nptⅡ，而非抗性植株没有扩增出nptⅡ基因，说明6 000 mg/L卡那霉素的筛选是可靠的。但这个浓度比刘方等(刘方等, 2008, 中国棉花, (8): 16)建议的要高，与马纪等(2008)相同。

在经卡那霉素抗性筛选的PCR分子鉴定中，没有扩增到pta，可能与马盾等(马盾等, 2007, 新疆农业科学, 44(S3): 105-107)报道的外源基因丢失和外源DNA的遗传不稳定有关。

本研究中选用了4种不同的受体材料，所做处理数相同，但只有陇棉2号得到的转化植株，这是否说明花粉管通道法的成功与否也与基因型依赖有关，仍需要做进一步的实验分析。

3材料与方法
3.1试验材料和试剂
本实验用西和半夏无菌苗、大肠杆菌(E. coli) DH5α、植物表达载体pBI121由本实验室保存。Taq DNA Polymerase、T₄ DNA连接酶、限制性内切酶购自大连宝生物公司，Rnase、GEM-T vector、DNA回收试剂盒等分别购自Sigma公司、Promega公司和中科开瑞生物公司。

参照Genbank半夏凝集素基因(AY191305.1)的核心序列，以及XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点，设计了PCR扩增正、反向特异引物。引物由大连宝生物公司合成。
以甘肃省棉花主栽品种陇棉2号(代号k9505, 白棉)为实验材料。

3.2半夏凝集素基因(pta)的扩增
按照CTAB法(王关林和方宏筠, 1998)提取半夏模板DNA进行PCR扩增和产物回收，方法见参考文献(张正英等, 2010)。

3.3扩增产物的克隆及鉴定
依照说明将扩增的PCR产物克隆到T-easy载体上，转化大肠杆菌DH5α。通过蓝白斑筛选、重组质粒限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物的电泳结果进行鉴定。

3.4序列测定与分析
阳性克隆送大连宝生物公司测序。测序结果用BLAST和DNAMAN 6.0软件分析。

3.5植物表达载体的构建
按照张正英等(2010)叙述方法进行载体构建。

3.6花粉管通道法介导的棉花遗传转化
参照《分子克隆》实验指南提取待转化质粒。参照刘方等介绍方法(刘方等, 2008, 中国棉花, (8): 16)进行转化，方法略有修改。先沿纵轴插入至子房中轴约2/3处，然后再退至约1/3处开始注射。涂抹赤霉素溶液(浓度40 mg/kg)于处理铃柄基部，以减轻幼铃脱落。同时，对转基因铃绑线以区分非转基因处理棉铃。质粒浓度10~20 μg/mL，每朵花注射用量10 μ。

3.7导入材料的田间筛选和室内分析
将收获的处理棉花种子种植于大田。利用4 000~5 000 mg/L的卡那霉素在T₁棉花苗期、盛蕾期喷涂倒2叶，选出抗性植株，单独收获。

将T₂棉铃种子按单粒种植，待长出第一片真叶时进行2 500 mg/L的卡那霉素溶液涂抹，每天分早、中、晚3次涂抹，连续7 d。统计棉花叶片的变化情况。表现为抗性的材料进一步进行4 000 mg/L、6 000 mg/L 的卡那霉素抗性检测。对检测到的抗性植株做PCR检测。

作者贡献
张正英是项目负责人，指导实验设计和数据分析，完成论文写作和修改。李淑洁、李静雯和王红梅是研究的执行人，分别开展了部分试验研究，完成了相应的数据分析。

致谢
本文由基金项目甘肃省科技支撑项目(1104WCGA188)以及甘肃省农业生物技术应用与开发项目(GNSW-2006-05)资助完成。在项目实施过程中，得到了甘肃省农业科学院作物所棉花课题组张秉贤研究员和冯克云副研究员的大力支持，对此表示衷心感谢。

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