杂交棉比常规棉品种增产幅度大，纤维品质较优，抗逆性强，特别是前期长势旺，抗苗病能力强，因此杂交棉品种在棉花生产中得到迅速的推广利用，深受棉农的认可。但是，近几年来棉种市场上F₂代冒充F₁代杂种，或者在F₁代杂种中掺有大量亲本种子的事实不断出现，使棉农蒙受损失。因此，如何鉴别棉种的真伪、品种纯度是一个亟待解决的问题(付小琼等, 2009)。

通常，棉种的真实性和纯度鉴定是常规的田间DUS特异性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和稳定性(Stability)测试检测，这种方法周期长，且易受环境条件的影响。20世纪90年代，随着分子生物学技术的快速发展，利用分子标记使室内鉴定品种的真实性和纯度成为可能。

SSR (Simple sequence repeat)分子标记具有重复性好，操作简单，呈共显性等优点，而且数量丰富，技术较为成熟，已被广泛地应用于玉米、水稻等农作物的品种真实性和纯度鉴定上(王凤格等, 2003; 李云海等, 1999)。运用SSR分子标记检测杂交种，一般需要提供亲本，在已知亲本的前提下筛选引物，鉴定品种纯度和真实性是十分有效的。

然而，在国家级、省级新品种区试中，参试单位无须提供参试品种的亲本材料，因此，这就需要在无亲本的情况下做纯度检测。本课题在多年国家棉花区试参试品种的纯度检测工作中积累经验，筛选出一批核心引物，已应用于700多个棉花材料上，取得了较好的效果。在杂交种的鉴别工作中，在无亲本信息或亲本材料的情况下，SSR引物扩增在供试材料中呈现共显性或非共显性，非共显性表明该SSR座位在该材料的两亲本无差异。显然，呈共显性的引物数量越多，表明两亲本的SSR多样性丰富，亲缘关系越远，杂种的优势更好。

本研究通过对邯6402杂交种的F₁单株、F₂群体(44个单株)指纹图谱的构建，比对单株间的图谱差异，试图利用SSR核心引物构建品种的指纹图谱，鉴别常规棉品种和杂交棉品种，区分F₁代杂交种和F₂代分离群体。

1结果分析
1.1邯6402 F₁的纯度检测
应用17对SSR核心引物检测邯6402 F₁ SSR标记纯度，纯度达100%，其中表1中前12对引物F₁呈共显性，后5对引物呈非共显性。图1、图2、图3和图4分别显示在引物NAU2343、NAU1255、NAU1186和NAU1369的扩增下，F₁ 24株棉花SSR扩增谱带一致，说明没有杂株，表明F₁在分子水平上纯度一致。其中NAU2343、NAU1255、NAU1186三对引物在F₁中呈共显性，而NAU1369在F₁中扩增呈非共显性。

图1 棉花杂种F1和F2分离株在引物NAU2343扩增下的SSR图谱 Figure 1 Banding patterns of F1 hybrids and F2 segregants generated by the SSR primers of NAU2343

图2 棉花杂种F1和F2分离株在引物NAU1255扩增下的SSR图谱 Figure 2 Banding patterns of F1 hybrids and F2 segregants generated by the SSR primers of NAU1255

图3 棉花杂种F1和F2分离株在引物NAU1186扩增下的SSR图谱 Figure 3 Banding patterns of F1 hybrids and F2 segregants generated by the SSR primers of NAU1186

图4 棉花杂种F1和F2分离株在引物NAU1369扩增下的SSR图谱 Figure4 Banding Patterns of F1 hybrids and F2 segregants generated by the SSR primers of NAU1369

表1 邯6402 F1和F2植株的图谱数字编码 Table 1 Digital coding transformed from the banding patterns of F1 hybrids and F2 separating individuals of Han6402

1.2邯6402 F₁的SSR指纹图谱的构建
在检测SSR标记纯度的同时，完成了F₁的17对SSR引物的指纹图谱，把电泳带谱信息转化成相应的数字编码表示(表1)，从而构成品种独一无二的身份标识，能作为品种真实性鉴定的依据，可以区别于其它品种。

1.3邯6402 F₂分离株的分子鉴定及图谱编码的确定
在12对共显性引物的扩增下，44株F₂棉苗中均呈现分离带谱。图1、图2和图3中三对共显性引物在F₂棉苗中分离严重。而5对在F₁棉株中呈非共显性的引物，在43株棉苗中扩增其图谱一致，其中第14号棉株在引物NAU1103和NAU2277扩增下呈共显性，这可能是与其它品种天然授粉所致，或混入杂株。图4显示在引物NAU1369扩增下44株F₂棉苗不分离，这与在F₁中呈现非共显性一致。第17号棉苗在17对引物中没有出现共显性带引物，显然，该株棉花可能是一个纯合株系，或者是外来的纯合品种，或者是因为供试SSR引物不足而漏检。其它42株棉苗在不同的引物扩增下均有共显性谱带，均为基因杂合株，有共显性谱带的引物数在3~10之间，每株棉苗均与F₁不同，42株棉苗之间相互比对也无相同。将F₂单株棉苗的扩增图谱转换为数字编码1、2和3 (表1)，构建F₂分离株的指纹图谱。

1.4从分子水平验证F₂性状比例
5对呈非共显性的引物在F₂群体中扩增，带谱基本稳定，但也有个别单株出现变异。12对呈共显性的引物在F2群体中扩增，“亲本1:亲本2:杂交型”分离比例如表2。由于个体数目偏少，尽管不能严格按1:1:2的比例，但有接近这个比例的趋势。对一个SSR位点的分离为3种类型的基因型，但对于多个位点而言，分离后植株间杂合程度非常高。

表2 17对SSR核心引物在F2单株中谱带分离比例表 Table 2 Separate ratio of SSR markers of the 17 pairs of core primers

1.5 F₁、F₂和常规棉的区别
F₁杂交种在共显性引物的扩增下，每个植株均表现为共显性，谱带类型为3型，整齐一致；在非共显性引物下，均为一致的简单带型。F₂群体在不同的引物扩增下基本上每一个植株的谱带都不一致，而且绝大多数为杂合体。常规棉在不同的引物扩增下，每个植株均表现为简单带型1或2，不会出现共显带3。根据不同植株谱带的结构可以判别F₁、F₂和常规棉。通过单株图谱的比对，也能初步分析出棉种的掺杂的成分。

2讨论
以F₁纯度好为前提，研究分子水平下F₂的杂合状况，在多个引物的扩增下，F₂分离株在基因水平上是非常杂合的。基因多位点的差异会导致表型性状的不一致，田间纯度差，经济性状分离，造成产量、品质不一致。生产上F₂的大量使用，使杂交棉发挥不了应有的优势，导致杂交棉在推广中受到负面的影响。

棉种的真实性室内快速鉴定，以及SSR标记纯度的检测，有利于种子公司的质量控制，也有利于种子监管部门的有效管理。棉花品种指纹图谱的构建，有利于育种家对棉种产权的保护。

在各级棉花区域试验过程中，有少数育种家急于求成用低世代材料参试，这样的品种一旦获得新品种认定，如果推广应用，很容易退化，给棉农带来损失。因此，经过SSR纯度检测，对纯度过低的品种实行淘汰制，是十分必要的。特别是有的育种家用F₁替代常规棉参试，造成不公平竞争，或使用重复品种参试，这种情况只有对参试材料进行指纹图谱的比对，才能得到有效的控制。我们期望建立一套SSR核心引物鉴别参试的每一个材料建设一个公平竞争的品种参试平台。

3材料与方法
3.1棉花材料
供试材料是国家棉花区试提供的参试品种邯6402 F₁，2011年4月27日种植于中国农科院棉花研究所东场试验地，在成株期田间取样24株；2011年收获邯6402 F₂种子，2012年3月种于生长箱内，取幼苗44株。

3.2DNA提取的方法
参考Paterson等的方法(Paterson et al., 1993)，结合本实验室改进后的CTAB法(付小琼等, 2011)，2011年用真叶提取DNA，2012年用幼苗的子叶提取DNA。应用17对SSR核心引物(表3)检测F₁的纯度并构建指纹图谱(中国农科院棉花研究所, 2011)，构建F₂ 44个分离株的指纹图谱。

表3 SSR核心引物序列表 Table 3 List of the SSR core primers

3.3基因杂合和纯合的判别方法
呈共显性引物的谱带为三种带型，定义三种带型为1、2和3，其中1和2为简单带型，为亲本类型，3为共显带型，凡是在不同引物上有3的棉株，表明在这些位点上是杂合的，可以判断这株棉花为基因杂合株，在所有引物的扩增谱带上均没有3，表明这株棉花的基因是相对纯合的。

作者贡献
付小琼是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；叶武威完成本论文的英文写作与全文修改工作。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究获得中国农业科学院棉花研究所杜雄明博士和棉花生物学国家重点实验室马丽华老师的持术支持，在此表示感谢。

参考文献
Cotton Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Scences, 2011, A novel kit to distinguish the cotton normal and hybrid varieties, China Patent, CN200910235514.4 (中国农科院棉花研究所, 2011, 辅助鉴别常规棉和杂交棉的方法及其专用试剂盒, 中国专利, CN200910235514.4)

Fu X.Q., Yang F.X., Liu F.J., and Wang X.L., 2011, A rapid extraction technology of cotton DNA and its application on regional cotton varieties tests, In: China Cotton Association, The 2011 annual meeting of China cotton association, Anyang, China, pp.124-127 (付小琼, 杨付新, 刘逢举, 王秀玲, 2011, 棉花总DNA快速提取技术及其在国家棉花区试中的应用, 中国棉花学会, 2011年年会论文汇编, 安阳, 中国, pp.124-127)

Fu X.Q., Yang F.X., Wang X.L., Tang L.P., and Guo F.G., 2009, A distinguishing method of normal and hybrid cotton varieties based on SSR markers, In: China Cotton Associa- tion, The 2009 annual meeting of China cotton association, Anyang, China, pp.125-126 (付小琼, 杨付新, 王秀玲, 汤磊鹏, 郭峰光, 2009, 利用SSR分子标记技术鉴别常规棉与杂交棉品种, 中国棉花学会, 2009年年会论文汇编, 安阳, 中国, pp.125-126)

Li Y.H., Xiao H., Zhang C.Q., Hu G.C., Yu Y.H., Jia J.Z., and Sun Z.X., 1999, Genetic variation of main parents of hybrid rice in China was revealed with simple sequence repeat markers, Zhiwu Xuebao (Chinese Bulletin of Botany), 41(10): 1061- 1066 (李云海, 肖晗, 张春庆, 胡国成, 于永红, 贾继增, 孙宗修, 1999, 用微卫星DNA标记检测中国主要杂交水稻亲本的遗传差异, 植物学报, 41(10): 1061-1066)

Paterson A.H., Brubaker C.L., and Wendel J.F., 1993, Rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analyswis, Plant Mol. Biol. Rep., 11(2): 122-127
http://dx.doi.org/10.1007/BF02670470

Wang F.G., Zhao J.R., Guo J.L., and Liu L.Z, 2003, Series of research on establishing DNA fingerprinting pool of Chinese new maize cultivars Ⅰ. The establishment of a standard SSR system fitting for maize cultivars' identification, Yumi Kexue (Journal of Maize Sciences), 11(1): 3-6 (王凤格, 赵久然, 郭景伦, 刘龙洲, 2003, 中国玉米新品种DNA指纹库建立系列研究Ⅰ.玉米品种纯度及真伪鉴定中SSR技术标准实验体系的建立, 玉米科学, 11(1): 3-6