黄萎病已经遍及中国各主产棉区，成为自枯萎病得到有效控制之后棉花生产上的第一大病害，严重影响棉花的产量。20世纪90年代，黄萎病连续大爆发并在中国各主产棉区大面积流行，其中1993年发病面积高达2.67×10⁶ hm²，损失皮棉1×10⁸ kg，1995年和1996年黄萎病连续爆发，发病面积达到1.6×10⁶ hm²和1.33×10⁶ hm²，尤其是北方棉区部分棉田出现成片病株落叶成光秆的现象，造成棉花大幅度减产，以致绝收(简桂良等, 2003, 中国棉花, 30(3): 13-14)。因此，如何防治黄萎病成为中国棉花生产上的重要研究课题。黄萎病属于土传性维管束真菌病害，多年实践证明化学防治、生物防治等方法抗病效果不明显，而培育抗病品种是预防控制该病的唯一出路，虽经研究人员多年努力，目前中国尚无高抗黄萎病的高产棉花品种应用于生产实践。

分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection, MAS)是随着现代分子生物学技术迅速发展而产生的新技术，利用与性状或者表型连锁的分子标记快速准确地分析个体的遗传组成，实现对基因型的直接选择，进行分子育种(Lee, 1995; Mohan et al., 1997)。这一技术已经在小麦、水稻、大豆、黄瓜、南瓜等多种农作物上得到应用(白智龙和周鸿, 2008; 谭行之等, 2010; 张芳等, 2010; 王竹林等, 2011; 殷得所等, 2011)。在棉花上，经过研究者的共同努力，已经初步构建了高密度的棉花遗传连锁图谱(Shen et al., 2006; Guo et al., 2008; Qin et al., 2008; Yang et al., 2008; Lin et al., 2009; Zhang et al., 2009; 2012; 蒋锋等, 2009, 中国科学, 39(9): 849-861)，并开始尝试应用于棉花分子标记辅助育种，包括棉花纤维品质(Guo et al., 2005)、抗病性状(王省芬等, 2007)、不育系恢复系改良(李朋波等, 2007)、抗根结线虫基因定位(Shen et al., 2010)等。综上研究表明，在育种过程中借助于分子标记技术手段进行辅助选择，可以有效地提高性状改良的选育效率，加快育种进程。但是到目前为止，将分子标记辅助选择技术应用到棉花抗黄萎病育种并获得成功的研究尚未见报道。

有鉴于此，本研究以抗病性较强的中植372为对象，利用和感病棉种军棉1号构建的F₂群体，对已经报道的SSR标记进行了筛选，获得了与中植372抗黄萎病性状相关标记6个，其中1个标记NAU1269与抗黄萎病性状紧密连锁。在此基础上，以中植372为抗性资源父本或者母本，通过高致病性人工黄萎病病圃高压筛选结合抗黄萎病分子标记NAU1269跟踪，旨在开发出可应用于棉花抗黄萎病分子育种的技术方法和路径。

1结果与分析
1.1抗黄萎病品种选育
以建立的人工黄萎病圃对300多个棉花材料进行高压筛选，获得了抗病性稳定的备选育种材料中植372。通过花粉管通道法导入Bt基因和转基因植株筛选后，海南加代并选育出65个具有优良农艺性状的单株；随后种植于人工黄萎病病圃，进行单株分离和高压抗性筛选，选育出兼具抗虫和抗黄萎病单株106个；混种并继续逐年高压抗性选育，最终获得具有优良农艺性状的抗黄萎病品系中植棉2号。

同时，利用抗病材料中植372和感病材料军棉1号配制组合构建的F₂作图群体，利用已公布的SSR引物筛选获得与黄萎病抗性紧密连锁的SSR标记NAU1269。在此基础上，通过抗病材料中植372与不同优良农艺性状的亲本配置组合，经过回交、海南加代选育、再杂交等过程，结合病圃高压筛选和黄萎病抗性紧密连锁的SSR标记NAU1269跟踪结果，选育出了具有优良农艺性状的抗/高耐黄萎病品种，包括中植棉6号、中植棉8号、新植杂2号、新植5号等(图1)。由此表明，结合田间病圃高压筛选和分子标记跟踪是一条可行的抗病虫育种方法，选育过程快速准确，育成的品种含有与抗黄萎病标记NAU1269连锁的区段，抗(耐)黄萎病性强且性状稳定，产量高，适应性广等特点。

图1 中植棉2号和新植5号 Figure 1 Phenotype of cv. Zhongzhimian2 and cv. Xinzhi5

1.2中植372抗黄萎病连锁标记对不同的抗、感棉种的分析
通过NAU1269对5个抗病棉种及其亲本中植372和3个感黄萎病棉种单株的DNA进行扩增，结果表明，感病棉品种军棉1号、新陆早8号、冀棉11号与抗病棉种新植杂2号均能够扩增到NAU1269标记的特异性条带，而亲本中植372和其它4个抗病棉种中植2棉号、新植5号、中植棉6号和中植棉8号均未扩增到该特异条带(图2)。由此说明，与NAU1269标记连锁的抗黄萎病区段在中植棉选育过程中得到稳定遗传。中植2棉号、新植5号、中植棉6号和中植棉8号均是以中植372为父本，通过其与黄萎病连锁的NAU1269标记辅助选育出的品种对黄萎病的抗性强且稳定，这也表明与NAU1269标记连锁抗黄萎病区段是选育品种黄萎病抗性的重要来源。

图2 SSR引物NAU1269在9个棉花品种的检测结果 Figure 2 Detection of NAU1269 SSR primer in nine cotton cultivars

1.3陆地棉黄萎病抗性相关分子标记对不同的抗、感棉种的分析
黄萎病抗性相关SSR引物NAU828是通过抗黄萎病海岛棉品种cv. Hai7124和陆地棉感病品种cv. Junmian1配制杂交组合，得到一个含128个单株的F₂分离群体，同时与cv. Junmian1回交得到含96个单株的BC₁群体所开发。该QTL定位D5染色体上，加性效应为0.67，LOD值为3.03，解释的表型变异范围为10.6% (Yang et al., 2008)。黄萎病抗性相关SSR引物NAU1225是通过抗黄萎病品系60182和感黄萎病品种军棉1号为亲本配制杂交组合，以其F₂为作图群体所开发。该QTL定位D9染色体上，加性效应为-0.65，显性效应为-0.21，LOD为16.06，解释的表型变异范围为19.8% (蒋锋等, 2009, 中国科学, 39(9): 849-861)。通过NAU828引物和NAU1225对5个抗病棉种及其亲本中植372和3个感黄萎病棉种单株的DNA进行检测，结果表明，类似于NAU1269扩增结果，感病棉种军棉1号、新陆早8号、冀棉11号与抗病棉种新植杂2号均能够扩增到NAU828标记的特异性条带和NAU1225标记的特异性条带，而亲本中植372和其它4个抗病棉种中植2棉号、新植5号、中植棉6号和中植棉8号均未扩增到该特异条带(图3)。由此说明，与NAU828和NAU1225标记连锁的抗黄萎病位点在中植棉种选育过程中得到稳定遗传，并且该抗黄萎病连锁的位点与NAU1269标记的抗黄萎病连锁位点呈共显性分离。

图3 SSR引物NAU828和NAU1225在9个棉花品种的检测结果 Figure 3 Detection of NAU828 and NAU1225 SSR primers in nine cotton cultivars

2讨论
20世纪90年代以来，继棉花枯萎病通过抗病育种的方法得到有效控制之后，中国棉花黄萎病的发生流行和危害日趋严重，凸显为棉花生产病害预防控制中的头号问题，也是世界性的难题，迫切需要培育抗黄萎病品种以应生产之需。但由于黄萎病致病机理复杂且棉花缺乏有效的抗病材料，在抗病性鉴定与选育过程中借鉴采用与抗枯萎病育种类似的方法很难奏效，容易导致后代材料选择不准确，育成品种抗性不稳定，产量、纤维等优良性状难以聚合，选育效率低下等问题。因此，寻找优良的抗黄萎病材料，开发或者筛选有效可靠的抗黄萎病分子标记，并进行分子标记辅助选育，就成为棉花抗黄萎病育种的重要技术路径。

近年来，随着棉花分子标记技术的发展，中国研究人员初步构建了高密度棉花遗传连锁图谱，获得了与部分农艺性状紧密连锁的可用于分子标记辅助育种的选择标记，取得了可喜的阶段性进展(Shen et al., 2006; Guo et al., 2008; Qin et al., 2008; Yang et al., 2008; Lin et al., 2009; Zhang et al., 2009; 2012; 蒋锋等, 2009, 中国科学, 39(9): 849-861)。然而，分子标记辅助育种技术在棉花抗黄萎病育种方面的应用较少，主要原因是棉花抗黄萎病机理复杂，多倍体杂交导致后代性状难以稳定，抗病性状鉴定稳定性和重复性一般，导致选育过程中容易出现材料当选或淘汰盲目性较大，以及育种亲本和杂交后代材料鉴定结果不准确。

为此，本研究尝试开发了高致病性病圃高压筛选和抗黄萎病分子标记跟踪相结合的方法，以抗病性较强的中植372为抗性资源父本或者母本，和不同优良农艺性状的亲本配置组合，经过回交、海南加代选育、再杂交等过程，通过高致病性人工病圃对杂交及选育后代的每一代材料进行高压筛选，初步鉴定选育材料的抗病性。同时，利用抗黄萎病分子标记对的每一代候选抗病材料进行检测跟踪，由此获得与抗黄萎病性状标记紧密连锁的优良抗性材料，最终成功选育出中植棉2号、新植5号等系列抗黄萎病国审棉花品种。该方法能够初步取得成功，拟有两个前提条件：一是构建了可用于鉴定棉花抗黄萎病性状的人工黄萎病圃，保证了候选材料抗病性状鉴定结果的稳定性和可靠性；二是筛选出了抗病材料中植372与黄萎病紧密连锁的分子标记。

近年来，通过众多研究者的共同努力，海岛棉和陆地棉抗黄萎病分子标记及分子辅助育种得到了较为快速的发展(房卫平等, 2001; 高玉千等, 2003; 甄瑞等, 2006; 王省芬等, 2007; Yang et al., 2008; 蒋锋等, 2009, 中国科学, 39(9): 849-861)。然而，由于棉花抗黄萎病遗传背景复杂，陆地棉与海岛棉抗病的遗传基础、杂交群体、不同棉花品种、不同黄萎病菌系以及不同发育时期都会影响抗黄萎病分子标记的稳定性和可靠性，给进一步的育种利用和生产应用带来了困难。本研究以抗病材料中植372和感病材料军棉1号配制组合构建了F₂作图群体，通过已公布的SSR引物筛选获得与黄萎病抗性紧密连锁连锁的SSR标记NAU1269。在育种实践中，除了通过人工病圃初步筛选杂交及后代材料之外，结合抗黄萎病标记NAU1269的跟踪检测结果进一步筛选含有该标记的后代材料进行后续选育，取得了良好的效果，表明与NAU1269标记连锁抗黄萎病区段是黄萎病抗性的重要来源。同时，利用已知的与黄萎病抗性相关的SSR标记NAU828和NAU1225检测本研究选育的品种也发现，它们与抗性高度相关，且三个与抗黄萎病连锁的SSR标记呈现共显性分离(图2; 图3)。

综上所述，在抗黄萎病育种过程中通过建立高致病性人工黄萎病病圃对选育材料进行高压筛选，并借助于分子标记手段进行辅助选择，可以有效地提高抗病性状改良的选育效率、加快棉花抗黄萎病育种进程。但是也要看到，本研究仅仅是一个初步的尝试，由于人工病圃在个别年份极端天气条件下对材料抗病性状的鉴定不稳定，棉花抗黄萎病性状由多个基因或者主效基因控制，与棉花抗黄萎病连锁的分子标记缺乏，本研究仅用一个与抗黄萎病性状连锁的标记进行筛选，存在部分后代选育的材料抗性表现一般的情况，有待在今后的研究中进一步改进和完善。从未来的发展看，建立高效的目标性状筛选平台，筛选或者开发与目标性状紧密连锁的分子标记，并将两者相结合是棉花分子标记育种方法探索、效率提高、抗病谱拓展、抗性持久与稳定的必由之路。

3材料与方法
3.1抗病棉种选育
人工黄萎病圃建立在中国农业科学院植物保护研究所新乡科研中试基地，属于黄淮海粮棉生态区，具有良好的自然生态条件和耕作制度代表性，病圃内发病均匀，受气候条件的影响较小，每年在常规抗黄萎病病圃中加入采自中国主产棉区之毛棉籽加工后获得致病力强的短绒土残渣粉碎混合作为黄萎病保持和更新菌种，用于病圃的棉籽残渣不少于1 200 g/m²土壤，带菌残渣均匀地施入田间，再翻耕2~3遍，使病菌与土壤混均匀，保证病圃土壤病菌数量在200/g土壤以上，减缓病圃衰退(张永军等, 2008, 中国专利, ZL200810222492.3)。

选择中植372及候选抗病组合材料种植在黄萎病病圃中，3次重复，每个重复2行，按棉花正常的播种时间和田间管理方式进行种植，田间保持适当湿度，以利于黄萎病的发生。依据《棉花抗病虫性评价技术规范-第5部分：黄萎病》规定的鉴定标准(GB/T22101.5-2009)，选择病情指数小于20的材料进行分子标记跟踪检测，选用的分子标记为利用抗病材料中植372和感病材料军棉1号配制组合构建的F₂作图群体所筛选出与黄萎病抗性紧密连锁的SSR标记NAU1269。将筛选的含有抗性标记抗病材料后代通过种间杂交、回交、海南加代选育、再杂交并重复辅以病圃高压选择和分子标记跟踪，直至筛选出具有抗黄萎病、产量高、品质优良的品系材料。

3.2选育品种与SSR引物
选取本研究培育的大面积推广的5个抗或者高耐黄萎病棉花品种，分别为中植棉2号、中植棉6号、中植棉8号、新植杂2号和新植5号，以抗病亲本中植372及3个高感黄萎病棉花品种军棉1号、新陆早8号和冀棉11号为对照(表1)，鉴定棉花抗黄萎病SSR标记与棉种抗性的关系。

表1 本研究使用的棉花材料 Table 1 Cotton cultivars used in this study

NAU1269为本研究利用抗病材料中植372和感病材料军棉1号配制组合构建的F₂作图群体所筛选到的与黄萎病抗性紧密连锁的SSR标记。与陆地棉黄萎病抗性相关的SSR引物NAU828 (Yang et al., 2008)和NAU1225 (蒋锋等, 2009, 中国科学, 39(9): 849-861)由南京农业大学张天真教授提供。

3.3 DNA提取
采用天根新型植物基因组DNA提取试剂盒(目录号: DP320-02)提取供试材料棉花基因组DNA。

3.4 PCR反应体系
PCR总反应体系为20 μL，其中DNA模板(40~ 80 ng/μL) 1 μL，2.5 mmol/L的dNTP 2 μL，10×Buffer 2 μL，10 μmol/L正反向引物各1 μL，Taq DNA聚合酶(TAKARA, 货号: DR001A) 0.25 μL，加ddH₂O至20 μL。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火40 s，72℃延伸30 s，32个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

3.5电泳检测
取2 μL PCR产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压200 V电泳60 min。采用NaOH银染方法对电泳后的聚丙烯酰胺凝胶进行染色显影。各种溶剂的配方和体积为：银染液，0.1% AgNO₃溶液1 L；显影液，16 g的NaOH，8 mL的37%甲醛，加去离子水定容到1 L；终止液，0.75%的Na₂CO₃溶液1 L。银染程序为：(1)去离子水漂洗15 s；(2)银染8 min；(3)去离子水冲洗15 s；(4)在显影液中轻摇至显带；(5)加入终止液，终止显影。

作者贡献
祁伟彦和张永军是本研究的实验设计和实验研究的执行人；张天真参与实验设计和提供引物；陈捷胤参与数据分析和论文初稿的写作；戴小枫是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
感谢转基因生物新品种培育科技重大专项项目(2011ZX08005)和国家863计划项目(2006AA10Z177)的支持。

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