EST-SSR(表达序列标签微卫星)技术就是利用已有的EST序列通过电子筛选鉴别SSR，然后根据SSR两端保守的侧翼序列设计引物，通过PCR扩增基因组编码区的微卫星序列，将扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再经银染后分析微卫星中核心序列重复单位数目的多态性(李卫国等, 2008)。EST-SSR标记源自于比较保守的转录区，其侧翼序列往往在物种之间高度保守，因此EST-SSR在相关物种之间具有很高的可转移性和通用性。对于尚未进行EST测序的物种，利用其近缘物种已有的EST-SSR标记或EST序列来开发目标物种的SSR标记不失为一种有效的替代方法，这加快了物种间的基因组信息转换，为基因组研究提供了新的思路和途径。利用EST开发SSR避免了SSR引物开发过程中的克隆和测序步骤，充分利用了现有数据，降低了开发成本，在生物上成为应用最广、发展最快、最为重要的分子标记(黄心尧和卢茵, 2010, 禽畜业, 256(8): 40-43)。

姜黄为姜科姜黄属植物姜黄(Curcuma longa L.)的干燥根茎，其主要成分为挥发油和油姜黄素类化合物(姜黄素, 去甲氧基姜黄素和去二甲氧基姜黄素)。姜黄挥发油除具有广谱抗菌消炎作用，还有抗癌、抗生育作用(陈晋红等, 2009)。而姜黄素是国内外食品行业允许使用的7大天然色素之一。现代药理研究证明，姜黄素类物质具有多种药理作用，包括抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂及抗动脉粥样硬化、抗肿瘤作用。其抗癌谱广，毒副作用小，是一种具有广泛应用前景的抗癌新药，有的已进入临床前毒理试验阶段(刘硕谦等, 2005)。

由于姜黄具有较高药用价值，国内外对姜黄的研究方兴未艾，NCBI数据库中积累了大量姜黄EST资源，极大增加了姜黄EST-SSR标记的开发能力。但目前关于利用姜黄EST序列建立其多态性的标记还未见报道。本研究利用现有的姜黄EST资源，对其进行搜索SSR并设计引物，建立了EST-SSR标记，以便于对该植物更好地研究、开发和利用。

1结果与分析
1.1姜黄EST-SRR的分布和频率
姜黄EST数据库共有12 593条序列，其中冗余序列80条，因而非冗余序列有12 513条，序列全长8 441.73 kb。此次研究发现24条序列具有2个位点，5条具有3个位点，其中6条具有重叠位点，共搜索到565个SSR位点，其中有452个位点能设计出引物(占80%)。

姜黄EST-SRR种类较为丰富，二至六核苷酸重复类型都能被检出，但出现的频率迥异。属于二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复的位点分别占总SSR 11.68% (66/565)、42.30% (239/565)、6.73% (38/565)、4.96% (28/565)和34.34% (194/565) (表1)。由此可见，在姜黄EST-SRR中，三、六核苷酸重复类型占主导地位，两者共占了总SRR的76.64%。从SRR的分布情况看，姜黄EST中平均每14.94 kb就出现1个SRR，但不同重复类型出现的平均距离各不一致， EST-SRR出现的频率越高，其平均距离越小(表1)。

表1 姜黄EST-SSR的分布特征

优势重复基元的比较分析表明，TA/AT是二核苷酸优势重复基元，占二核苷酸总数的42.42% (28/66)；三核苷酸中TCT/AGA，GAG/CTC，GAA/CTT均是出现22次，每个占三核苷酸总数的9.21%，共占27.62%；四核苷酸中AATA，TAGA和五核苷酸中TCCTT/AGGAA，AGAAG/TCTTC比例相当，分别共占各苷酸类型总数的21.05% (4*2/38)，21.43% (3*2/28)；六核苷酸优势重复基元不明显，GGCGAC，CATTCC，GCGGCA/CGCCGT，GAGGCG/CTCCGC每个仅占六核苷酸总数的2.58% (5/194)，共占10.31%。

1.2姜黄EST-SRR重复单位的特点
1.2.1重复次数
重复单元的重复次数是SSR的重要特征。就姜黄EST-SRR重复单元的重复次数而言，在3~11次的重复范围内都有连续分布，其中最多的是3次重复138个，占总SSR的24.42%；其次为6次重复124个，占21.95%；然后是7次重复70个，占12.39%；其它重复次数的则少得多，均未超过10.00% (图1)。姜黄EST-SSR重复单元的重复次数最多的达到45次，但仅有一例，即AG重复类型。

图1 姜黄EST-SSR主要重复单元的重复次数分布

1.2.2基序长度
从图2可以看出，基序长度为18 bp处绝对优势，占总SSR的46.02%；长度为24 bp、21 bp次之，分别占14.34%、12.04%；而长度为20 bp、30 bp、22 bp及其它的则比较少，均未超过10.00%。Temnykh等(2001)报道，当SSR长度在20 bp以上(含20 bp)时，在不同品种间显示出较高的多态性；当长度在12~20bp之间时，SSR的多态性较低；当长度小于12 bp时，SSR的多态性很低。在姜黄EST-SSR搜寻过程中设置的最小长度标准为18 bp，已完全过滤多态潜能很低的小于12 bp的SSR。在本研究所发掘的565个SSR中，长度20 bp以上的SSR有299个，18~20 bp的SSR有266个，即多态潜能高的SSR占52.92%，多态潜能次高的SSR占47.08%。
 

图2 姜黄EST-SSR主要基序长度分布

1.3 EST-SSR通用性检测
根据统计的SSR位点的EST序列信息，共设计了452对引物。为了验证姜黄EST-SSR标记的有效性，按二、三、四、五和六核苷酸在总SSR中所占比例，随机选取30对引物，其中包含两条Over-laped SSR所对应的引物，对生姜的基因组DNA进行PCR扩增，共筛选出20对扩增出清晰条带，有效扩增率为66.67%，6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果见图3。在30对EST-SSR引物中，20对有扩增产物，有3对引物扩增出单一带谱，其余17对引物检测的等位基因较丰富在2~6个之间，平均3.06个/对(表2)。该实验说明利用姜黄EST序列开发EST-SSR标记是有效且可行的。

表2 20对姜黄EST-SSR引物信息

图3 6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图

1.4 EST-SSR靶向基因的功能分析
值得关注的是，EST-SSR可能与基因功能表达具有直接或间接关系，从而强化了SSR标记在遗传研究中的应用。筛选出姜黄20对引物所对应的EST，预测ORF并概念性翻译序列，随后采用BLASTp搜索蛋白质数据库，发现获得的位点中5个(5/20, 25%)为编码假定蛋白，1个(1/20, 5%)为未知蛋白，4个(4/20, 20%)为未见报道，而9个(9/20, 45%)的SSR位点可被成功进行功能注释，其中有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶，墨西哥类蜀黍硬壳构造Tga1，氨基酸转运蛋白，叶绿素a/b结合蛋白，EF手臂钙离子结合蛋白CCD1，HemY蛋白，转录因子，RNA结合蛋白Nova-1。与此同时，我们发现8个(8/20, 40%)具有明显结构域。详细结果见表2。

2讨论
对NCBI数据库12 593条姜黄EST序列去除冗余后，共得到非冗余序列12 513条，序列全长8 441.73 kb，从中共搜索到565个SSR位点，平均距离为14.94 kb。本研究中得到的姜黄EST-SRR平均分布距离低于很多植物，如黄瓜(3.80 kb) (胡建斌和李建吾, 2008)、杨树(3.88 kb) (张新叶等, 2009)、大豆(6.62 kb) (陈相艳等, 2009)，但与烟草(14.21 kb) (胡重怡等, 2009)相近，这种差异可能是物种间的真实SSR信息差异或搜寻SSR时所用标准(如最低长度、是否统计单核苷酸)不同造成的。

从目前的报道来看，大多数植物的EST-SSR以三核苷酸和二核苷酸重复类型为主(李永强等, 2004)。分析姜黄EST-SSR的重复类型，发现三、六核苷酸重复类型占主导地位，两者共占了总SRR的76.64%，其中三核苷酸42.30% (239/565)，六核苷酸34.34% (194/565)。这与前人研究其他植物结果存在一定差异。优势重复基元的比较分析表明，TA/AT是二核苷酸优势重复基元，占二核苷酸总数的42.42% (28/66)，这与Powell等认为植物二核苷酸重复中主要是(AT)n的看法一致(姜春芽等, 2009)。GC重复基元在多数植物中很难见到，如拟南芥、杏树、桃树、水稻和玉米(Gao et al., 2003)等植物中都没发现。姜黄EST-SSR二核苷酸中同样未发现GC基元。

研究结果表明，利用姜黄EST信息建立SSR标记是可行的且在生姜中具有通用性，为其它姜科植物的进一步研究奠定了基础。

3材料与方法
3.1姜黄EST序列的获得
登陆NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/guide/)，以Curcuma longa为关键词搜索EST序列，共获得EST序列12 593条(截至2011年2月22日)。

3.2姜黄EST-SSR的发掘及引物设计
利用在线程序Websat (http://wsmartins.net/websat/)对所有下载的EST序列进行SSR位点搜寻。搜寻标准为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸，最少重复次数分别为9、6、5、4和3。采用Websat内置Primer Premier 3.0程序，使用默认参数对含有SSR的EST设计PCR引物。

3.3姜黄EST-SSR的统计分析
对于已设计出引物的EST序列，通过重复类型、Tm值和引物序列比对进一步去除冗余EST。姜黄EST-SSR类型、数目及出现频率等采用Excel软件进行统计分析。根据重复类型所占比例随机选取30对引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

3.4姜黄EST-SSR引物性能检测
     采集新鲜生姜块茎于-20℃保存，采用改良CTAB法(张盈娇, 2006, 荨麻部分药理作用及有效成分的研究和干姜遗传多样性研究, 硕士学位论文, 成都中医药大学, 导师: 卫莹芳, pp.37-41)提取生姜基因组DNA。PCR扩增体系为(25 μL)：10×buffer 2.5 μL， Mg²⁺ 25 mmol/L 1.5 μL， dNTP 10 mmol/L 0.5 μL，上下游引物100 μmol/L各1 μL，Taq酶5.0 U 0.2 μL，模板DNA 50 ng/μL 1 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，51℃退火40 s，72℃延伸50 s，38个循环；72℃终延伸7 min，8℃保存。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，以检测扩增产物的可用性，对有清晰条带的引物用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染检测其多态性。

作者贡献
在整个实验过程以及最终成稿期间，何广海在张智俊老师、罗淑萍老师的指导和帮助下完成选题、文章初稿的写作以及文章的整体构思、修改和完善。

致谢
本研究由国家“863”项目(2007AA021403)、浙江省自然科学基金资助项目(Y307469)、浙江农林大学人才启动基金共同资助。特别感谢杨丽学姐、管雨学姐在实验过程中提供的帮助。感谢两位匿名的同行评审人的评审意见和修改建议。

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