大豆对大豆花叶病毒抗病基因RSC-12的标记定位与标记辅助选择 
马莹 
,
李海朝 ,
王大刚 ,
刘宁 ,
智海剑 
,
李海朝 ,
王大刚 ,
刘宁 ,
智海剑
南京农业大学国家大豆改良中心, 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 南京, 210095
作者 通讯作者
豆科基因组学与遗传学, 2010 年, 第 1 卷, 第 2 篇 doi: 10.5376/lgg.cn.2010.01.0002
收稿日期: 2010年05月14日 接受日期: 2010年07月06日 发表日期: 2010年11月22日
作者 通讯作者
豆科基因组学与遗传学, 2010 年, 第 1 卷, 第 2 篇 doi: 10.5376/lgg.cn.2010.01.0002
收稿日期: 2010年05月14日 接受日期: 2010年07月06日 发表日期: 2010年11月22日
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推荐引用：
Ma et al., 2010, Molecular Mapping and Marker Assisted Selection of Resistance Gene RSC-12 to Soybean Mosaic Virus in Soybean, Douke Jiyinzuxue Yu Yichuanxue (online) (Legume Genomics and Genetics) Vol.1 No.2 (doi:10.5376/lgg.cn.2010.01.0002) (马莹等, 2010, 大豆对大豆花叶病毒抗病基因RSC-12的标记定位与标记辅助选择, 豆科基因组学与遗传学(online) Vol.1 No.2 (doi:10.5376/lgg.cn.2010.01.0002))
摘要
利用对大豆花叶病毒株系SC-12分别表现抗病和感病的齐黄22和南农1138-2为亲本杂交的F1以及包含219个单株的F2群体和F2：3家系，研究了大豆对SC-12的抗性遗传，采用分离群体分组分析法(BSA)，应用Mapmaker3.0软件进行抗性基因的连锁分析，对抗性基因进行了标记定位，并利用所获得的SSR标记对F2、F3、F4三个世代的群体进行抗性基因的标记辅助选择。结果表明，抗感杂交的F1表现抗病，F2群体抗感分离比例符合3:1，F2：3家系呈1抗:2分离:1感的分离比例，说明抗性由一对显性基因控制。在F连锁群上找到7个与抗病基因RSC-12连锁的SSR标记，标记顺序和距离为：Sat_297 6.4 cM Sat_234 4.9 cM Sat_154 1.1 cM Satt114 0.7 cM SOYHSP176 1.6 cM Satt334 2.4 cM RSC-12 6.3cM Sct_033。利用抗病基因两侧的SSR分子标记Satt334和Sct_033对齐黄22×南农1138-2的F2、F3和F4世代进行抗病基因的标记辅助选择(MAS)以验证标记定位的可靠性和实用性。结果表明：单独使用标记Satt334或Sct_033对三个世代的抗性基因MAS准确率均在85%以上，同时使用两个标记准确率达近95%。证明2个标记可以有效地代替人工接种鉴定用于大豆抗SMV育种中对抗病基因RSC-12的选择。
关键词
大豆；大豆花叶病毒； 抗性遗传；基因定位；标记辅助选择
大豆花叶病毒(soybean mosaic virus, SMV)病是大豆生产上的一种世界性病害，严重影响大豆产量和品质。种植抗病品种是减少危害发生的最经济、有效和安全的措施。利用传统育种方法培育抗病品种不但费时, 而且受病毒接种鉴定条件的限制，许多育种单位难以实施。分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection, MAS)既快速又简便，且不易受环境条件的影响，已成为提高育种效率的有效方法。简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)多态性标记是共显性标记，具有多态性丰富，试验重复性好，简单，快捷等诸多优点，已在MAS育种中得到广泛应用。
在大豆抗性研究中，迄今已鉴定出多个SSR标记，如Satt309 (Cregan et al., 1999; 王文辉等, 2003)、Sat_168 (Cregan et al., 1999)、Satt038 (Mudge et al., 1997; Prabhu et al., 1999)、Satt130 (Mudge et al., 1997)、Sat_162 (蒙忻等, 2003)、Satt610 (蒙忻等, 2003)等，用于大豆胞囊线虫抗性辅助选择。但大豆抗SMV研究还主要集中在对SMV抗性基因的定位方面。Yu et al.(1994), Jeong et al. (2002), Hayes et al. (2000)将抗SMV基因Rsv1、Rsv3和Rsv4分别定位到大豆连锁群F、B2和D1b+W连锁群上，并找到了与抗病基因紧密连锁的分子标记。张志永等(1998, 科学通报, 43(20): 2197-2202)、王永军等(2004)对SMV株系Sa、SC-8、SC-9、N1和N3的抗病基因进行了标记定位。郑翠明等(2001)对东北的SMV3号株系进行了RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)标记定位。以上定位多数采用RFLP (Restriction fragment length polymorphism)和RAPD标记，可利用性较低。最近，Li等(2006)和白丽等(2009)分别将抗SC-14、SC-11的抗病基因定位在F连锁群上，并找到了位于抗病基因两侧紧密连锁的SSR分子标记。而与大豆花叶病毒抗病基因紧密连锁的分子标记的应用研究至今未见报道。
本研究测定了广谱抗性品种齐黄22对SC-12抗性遗传方式，找到了与抗病基因紧密连锁的分子标记，并定位抗病基因，同时利用与抗病基因紧密连锁的分子标记进行标记辅助选择以验证其选择效率，以期为大豆抗大豆花叶病毒病育种及抗性基因聚合提供理论和方法指导。
1结果与分析
1.1大豆对SMV株系SC-12的抗性遗传分析
抗病性鉴定结果(表1)显示齐黄22 (P1)对SC-12表现抗病，南农1138-2 (P2)表现感病，齐黄22×南农1138-2的F1表现抗病，F2分离结果经χ2测验符合3抗：1感分离比率，F2:3分离结果经χ2测验符合1抗:2分离:1感的分离比率，表明齐黄22对SC-12的抗性是由一对显性基因控制，这里以RSC-12表示。
.png){kind=small} 表1齐黄22×南农1138-2各世代对SC-12的抗性反应 Table 1 Segregation analysis of reaction to SMV strain SC-12 in Qihuang No.22×Nannong1138-2 |
1.2抗病基因RSC-12的SSR标记定位
采用BSA法构建抗感池，筛选出在亲本及抗感池间均有多态的7对SSR标记，分别是Sat_297、Sat_234、Sat_154、SOYHSP176、Satt114、Satt334 (图1)和Sct_033。这些标记经χ2测验，在分离群体中均呈1:2:1分布(表2)。利用Mapmaker3.0软件进行标记与抗病基因RSC-12的连锁分析，结果发现7个标记均与RSC-12连锁。根据Song et al.(2004)整合的大豆分子标记公共图谱，将齐黄22的抗病基因RSC-12定位在F连锁群上。这7个SSR标记与RSC-12的位置关系及遗传图距为Sat_297 6.4 cM Sat_234 4.9 cM Sat_154 1.1 cM Satt114 0.7 cM SOYHSP176 1.6 cM Satt334 2.4 cM RSC-12 6.3cM Sct_033 (图2)。
.png) 表2与RSC-12连锁的分子标记在齐黄22×南农1138-2 F2群体中的分离分析 Table 2 Segregation analyses for molecular markers closely linked to RSC-12 in a F2 population from the cross of Qihuang22 and Nannong1138-2 |
 .png){kind=small} 图1 与RSC-12连锁的SSR标记Satt334在齐黄22×南农1138-2的F2群体中的基因型分析 Figure 1 Analyses for genotype of SSR marker Satt334 closely linked to RSC-12 in F2 population of Qihuang×Nannong138-2 |
 图2 大豆抗花叶病毒基因RSC-12的遗传连锁图谱 Figure 2 The genetic linkage map of SMV resistance gene RSC-12 |
1.3对抗病基因RSC-12的标记辅助选择效率
统计F2代抗感表型及与RSC-12两侧紧密连锁的SSR标记Satt334、Sct_033在F2群体中的分子带型，并对齐黄22×南农1138-2的F3和F4代群体进行接种鉴定，同时选用Satt334和Sct_033对每个单株进行分子标记检测。利用所获得的数据评估这两个标记在辅助选择RSC-12时的效率，以验证标记的可靠性及实用性。
在F2群体中，有164株在接种鉴定中表现为抗病，用Satt334检测159株表现为抗病带型(P1或F1带型)，符合率为97.0%，用Sct_033检测有155株表现为抗病带型，符合率为94.5%；在接种鉴定中表现为感病的55株单株中，用Satt334检测到54株表现为感病(P2)带型，符合率为98.0%，用Sct_033检测有49株表现为感病带型，符合率为89.1%(表3)。同时用Satt334和Sct_033检测的均表现抗病带型的153个单株中，接种鉴定全部表现为抗病，表明同时使用位于RSC-12基因两侧的Satt334和Sct_033标记，可使MAS的准确率达到100% (表4)。
.png) 表3齐黄22×南农1138-2各世代群体SSR标记检测与接种鉴定的符合率 Table 3 Coincidental rate between SSR detection and inoculation in F2, F3 and F4 populations |
.png){kind=small} 表4同时使用RSC-12基因两侧的分子标记的MAS符合率 Table 4 MAS efficiency when two markers flanking RSC-12 were co-used |
同样，使用标记Satt334和Sct_033对F3、F4代做标记辅助选择，单个标记的标记辅助选择效率都在85%以上(表3)，同时使用Satt334和Sct_033选择抗病单株符合率均可达100% (表4)。
本研究结果表明，利用SSR标记Satt334和Sct_033鉴定待测植株的抗性与人工接种结果表现出很高的符合率。因此，在大豆抗SMV育种中，完全可以将SSR标记Satt334和Sct_033应于对抗性基因的选择。
2讨论
本研究将齐黄22对SC-12的抗性基因RSC-12定位在F连锁群上的Satt334和Sct_033之间，而Li等(2006)，白丽等(2009)分别将齐黄1号对SMV SC-14和SC-11的抗性基因RSC-14和RSC-11也定位在F连锁群上的Satt334和Sct_033之间。因齐黄1号是齐黄22的亲本之一，齐黄22与齐黄1号的抗性可能由同一基因控制。也有研究报道，Satt334和Sct_033与R基因的密集区紧密连锁(刘峰等, 2000, 自然科学进展, 10(11): 1012-1017)。究竟对3个株系的抗性是同一个基因控制，还是连锁的3个基因控制尚需进一步研究。
从实验成本和技术可行性考虑，开展MAS首选基于PCR的分子标记。郑康乐等(1997)认为，用于MAS的分子标记与目标基因的遗传距离最好小于5.0 cM。Yu等(1994)、Jeong等(2002)、Hayes等(2000)、张志永等(1996)、郑翠明等(2001)和王永军等(2004)定位多数采用RAPD和RFLP标记，距离较远，且重复性差或实验过程复杂、费工费时，在育种利用上有较大限制。本研究所获得的与抗SMV基因紧密连锁的Satt334和Sct_033是共显性的SSR标记，通过简单便捷的试验操作在早代就可选择纯合型单株；且选择效率高，利用抗病基因单侧标记选择抗病单株选择效率在94%以上，而同时使用两侧的标记进行抗病单株选择准确率达100%。因此，在大豆花叶病毒抗病育种中利用Satt334和Sct_033进行MAS是完全可行的。
近年来育种家们致力于将多个不同抗性基因聚合到一个优良品种中，以提高抗性，拓宽抗谱，延长优良品种的使用年限。通过传统的病原接种法不能同时对同一植株接种不同株系，因此，给杂交后代个体的筛选鉴定带来很大不便。而应用与目标性状紧密连锁的分子标记进行辅助选择，可以快速准确地将多个目标基因聚合于同一品种中，提高了育种效率。本研究所获得的对SMV抗性基因连锁的SSR标记为大豆抗病基因的聚合提供了基础信息。
3材料与方法
3.1材料
抗大豆花叶病毒株系SC-12的大豆品种齐黄22由沂水平顶黄、齐黄1号、莒选23、农杂9-3复交选育而成(徐冉等, 2004)，兼抗多个不同的SMV株系(尚佑芬等, 1999; 李海朝等, 2006; 王修强等, 2003)。齐黄22与感病品种南农1138-2杂交获得F1、F2、F2:3、F3、F4。
参试大豆花叶病毒株系SC-12是一流行弱毒株系，在我国北方春大豆区与黄淮和长江中下游地区都有分布，它与东北2号株系群(吕文清等, 1985)在鉴别寄主上的症状反应相似(郭东全等, 2005; 王延伟等, 2005)。
3.2植株表型鉴定
将亲本及其杂交各世代于温室内盆栽，在第一对真叶展平时人工摩擦接种大豆花叶病毒株系SC-12，第一对复叶展开时重复接种。接种后一周开始调查记录发病情况，连续观察3周，并挂牌标记显示症状的植株，以防后期隐症的影响。定期喷药，以防蚜虫传毒造成交叉感染。
凡是上位叶有花叶症状反应的均视为感病。统计调查发病情况，对各组合分离世代的调查结果做χ2适合性测验。
3.3抗感池的制备
采用CTAB法提取亲本，F1、F2、F3和F4群体各单株基因组DNA。从齐黄22×南农1138-2的F2群体中分别随机选取各15株抗病、感病植株的DNA等量(约1 μg)混合构成抗池、感池。
3.4 PCR反应及电泳检测
SSR引物序列来自Soybase (http://129.186.26.94/ssr.html)，由上海英骏生物技术公司合成。
在分子标记筛选以及MAS时，PCR反应体系总体积为10 μL，反应液包括50 ng模板DNA、1.5 μL 10×PCR buffer、2 mmol/L MgCl2、0.3 μmol/L引物、0.24 mmol/L dNTP和0.6 U Taq酶，ddH2O补至10 μL，石蜡油覆盖。PCR反应程序为：94℃预变性3 min，然后每个循环：95℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸40 s，共30个循环，最后72℃保温8 min。
PCR扩增产物中加入2 μL溴酚蓝缓冲液，在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离产物，然后银染检测。
3.5分子标记与基因的连锁分析
根据分离群体中分子标记多态性及鉴定的抗感表型，应用Mapmaker3.0软件(Lander et al., 1987)计算连锁距离，临界LOD值为3.0，用Kosambi函数将重组率转换成图距单位厘摩(cM) (Kosambi, 1944)。利用Excel的一种宏绘制连锁图(刘仁虎和孟金陵, 2003)。
致谢
本研究由国家自然科学基金资助项目(30971815)、国家科技支撑计划资助项目(2006BAD01A04)、国家高技术研究发展计划资助项目(2006A10A111)、农业部大豆产业技术体系(nycytx-04)、高等学校创新引智计划资助项目(B08025)和转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08004-004)共同资助。
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