诱变育种就是人为地利用物理和化学等因素，诱发作物产生变异，通过对突变体的选择和鉴定，培育优良品种直接运用于生产，或培育新的种质资源来改良已有的品种(张秋英等, 1996)。突变是遗传变异的根本来源，对遗传、育种和进化都具有重要意义。秋水仙素是良好的多倍体诱导剂，多用来进行染色体加倍。秋水仙素可以诱导细胞染色体的加倍，并可诱发生物性状的遗传变异(Tiwarl and Khanorkar, 1984, 刘泽等, 2006)。

小豆属于豆科(Leguminosae)，蝶形花亚科(Papilionaeeae)，菜豆族(Phaseoleae)豇豆属(Vigna)中的一个栽培种，是中国古老的栽培作物之一。小豆种子营养丰富，高蛋白、低脂肪，并具药用价值，是中国传统出口创汇和药食兼用的食用豆类作物(余跃辉, 2005)。近几年，发现其在禾本科和蔬菜中具有诱发等位基因突变，产生早熟、多花、大叶、多分蘖和多叶绿体的变异材料(蔡国海等, 1992; 张秋英等, 1996, 2000; Caroline et al., 2003; 汪剑鸣, 2008)，但在豆科植物中用秋水仙素诱发变异的报道较少。本文通过秋水仙素处理获得了一批性状变异材料，同时筛选出具有优良性状变异的植株，为小豆基因定位与克隆、功能基因组研究、种质资源创新及诱变育种提供了有价值的基础材料。

1结果与分析
1.1不同浓度秋水仙素诱变对小豆农艺性状的影响
秋水仙素诱变小豆M1在出苗率、成株率方面较对照有明显降低，相对出苗率和相对成株率都低于50%。秋水仙素处理的最大变化为M1株高较对照明显降低，在各代产量构成因素方面，处理较对照有所增加。两种不同浓度秋水仙素处理小豆M1代出苗率、成株率及变异率有较大差异，处理浓度越大，出苗率和成株率越小，变异率越大，这可能是因为高浓度对种子的伤害程度较大(表1)。

表1不同浓度秋水仙素诱变小豆M1代的出苗率、成株率及变异率 Table 1 Percentage of plants and mutants of M1 treated by different concentrations of colchicine

诱变M1代株高表现为处理浓度越大，株高越矮，综合主茎节数、主茎分枝数、单株荚数、单株产量和百粒重等农艺性状表现及与对照差异显著性比较分析，以0.2%秋水仙素处理效果最佳(表2)。

表2不同浓度秋水仙素诱变M1代农艺性状平均表现 Table 2 The Agronomic traits of M1 by different concentrations of colchicines

对获得的变异材料的M2和M3代的农艺性状进行考察，株高与对照趋于相同(表3; 表4)。但在单株荚数、单株粒数、单株产量、百粒重方面，处理明显优于对照。表3表明，秋水仙素处理M2代与对照相比，单株粒数在5%水平上达到显著差异，百粒重在1%水平达到极显著差异。在处理间，除百粒重达到显著性差异以外，其它项目差异不大。0.2%处理的单株粒数较小，但单株产量较0.4%处理增加33.98%、百粒重增加10.75%，所以，0.2%秋水仙素处理为佳处理浓度。

表3不同浓度秋水仙素诱变M2农艺性状平均表现 Table 3 The Agronomic traits of M2 by different concentrations of colchicines

表4不同浓度秋水仙素诱变M3艺性状平均表现 Table 4 The Agronomic traits of M3 by different concentrations of colchicines

表4的显著性分析表明，秋水仙素诱变M3代与对照的株高、主茎分枝数、单株荚数均没有显著性差异，而主茎节数、荚宽、百粒重在1%水平达到极显著差异。在处理间，0.2%处理的主茎节数、主茎分枝数、单株荚数、单株粒数、单株产量、百粒重均比0.4%处理高，同时综合考虑两种处理间株高的差异，得出0.2%秋水仙素处理为最佳处理浓度。

1.2不同浓度秋水仙素诱变小豆M3突变体类型
秋水仙素处理在诱变M1代中植株学性状出现了变异，这些变异分布在叶部性状、植株性状、豆荚性状、籽粒性状等方面，如浅绿叶、剑叶、肾叶、高秆、粗茎、黑荚、暗红粒和大粒类型等。不同浓度秋水仙素处理所得M3突变体类型有一定差异，0.4%处理的变异较0.2%更为丰富，在0.4%处理中还出现了浅绿叶突变体、剑叶突变体、上部剑叶下部肾叶突变体、高秆突变体、少分枝突变体、粗茎突变体、黑荚突变体、暗红粒色突变体及大粒突变体等0.4%处理独有的突变类型(表5)。

表5秋水仙素处理小豆京农6号M3突变体类型 Table 5 The variation types of M3 induced by colchicines in Jingnong6 of Azuki Bean

1.2.1小豆M3叶部性状变异
京农6号的叶片为卵圆形，在0.4%秋水仙素处理叶型突变频率为12.92%，出现了19株剑叶突变类型、10株小密叶突变类型和12株肾叶突变类型(图1)，同时出现了7株为上部剑叶下部肾叶；0.2%秋水仙素处理群体中共出现了17株肾叶突变类型、6株小密叶突变类型，叶型突变频率为2.40%。

图1 小豆M3的叶型突变类型 Figure 1 Leaf shape mutant in bean M

在0.4%秋水仙素处理群体中出现9株深绿叶突变类型、8株浅绿叶突变类型、3株黄花叶突变类型和4株黄斑叶突变株，叶色突变频率为2.40%。0.2%秋水仙素处理M3群体中共有2株深绿叶突变株、2株黄花叶突变株和1株黄斑叶突变株(图2)，叶色突变频率为0.50%。

图2 小豆M3的叶色突变类型 Figure 2 Leaf color mutant in bean M3

1.2.2小豆M3植株性状变异
秋水仙素处理群体中出现蔓生变异株，其产量构成因素和对照没有明显差别；并且在0.4%秋水仙素处理群体中出现了株型紧凑、直立、粗壮变异株。

京农6号株高一般为40~60 cm，其平均株高为42.51 cm，而在0.4%秋水仙素处理的群体中发现了10株株高在70~87 cm的高秆突变体(图3)，其平均株高为78.05 cm，比对照增加83.6%。

图3 小豆M3的株高突变体 Figure 3 Plant height mutant in bean M3

7株分枝数为1的寡分枝突变株。其秋水仙素处理后植株分枝数发生了显著变异，出现了多分枝、寡分枝变异株，对照京农6号分枝数一般为3~4个，而在诱变群体中出现了3株分枝数为8的多分枝突变株，同时在诱变群体中出现了中寡分枝突变株都是0.4%秋水仙素处理所得。

1.2.3荚色和籽粒性状突变
京农6号为白荚，但在0.4%秋水仙素处理的群体中出现了15株黑荚突变体(图4)，突变率为1.5%。

图4 小豆M3的荚色突变体 Figure 4 Pod color mutant of in bean M3

对照京农6 号为深红粒，在处理群体中出现了暗红色粒和浅红色粒突变类型，采用色彩色差仪测得不同粒色突变株的平均L*、b* 和a* 值(表6)。并且荚色与粒色密切相关，粒色较深的突变株多为黑荚突变株(图5)，且全部的暗红粒突变株均由0.4%秋水仙素处理所得。

图5小豆M3的粒色突变体 Figure 5 Seed color mutant in bean M3

表6不同粒色突变体的L*、a*、b*值 Table 6 L*, a*, b* of seed colour mutant

京农6 号小豆表现为光滑长圆形粒，平均百粒重为17.67 g。在0.4%秋水仙素诱变群体中有3 株大粒突变体(图6)。大粒突变体平均百粒重为37.12 g，比对照增加47.39%。

图6 小豆M3的粒形突变 Figure 6 Seed shape mutant of in bean M3

1.3 生育期变异
京农6 生育期为90~95 d，在诱变群体中共发现9 株早熟突变株，较对照早熟10~15 d。8 株 晚熟突变体，较对照晚熟7~10 d。

1.4 M4性状稳定性分析
对诱变后代突变体性状进行连续的跟踪观察，鉴定其稳定性（表7）。分析了208个突变株系性状的稳定性，涉及叶形、叶色、株形、株高、结荚习性、成熟特性、荚色、粒色等17种突变体类型，获得142个可稳定遗传的株系。其中高秆、蔓生和黄白粒突变体后代株系可完全稳定遗传；肾叶、小蜜叶、黑荚、剑叶突变体性状基本能够稳定遗传；而新叶黄化、上部剑叶变异株性状分离的株系较多，遗传稳定比率相对较低，部分M3表现上部剑叶的植株M4代出现剑叶、卵圆叶、肾叶分离。

表7秋水仙素诱变M4代性状稳定性分析 Table 7 Analysis on genetic stability of mutant traits in M4 induced by colchicines

2讨论
化学诱变具有设备简单、操作方便等优点，据有些资料分析，化学诱变剂作用于基因，具有明显的座位特异性，其诱变效果与诱变剂的种类关系密切。以往，人们在化学诱变育种上常用的诱变剂有甲基磺酸乙酯(EMS)，硫酸二乙酯(DES)，叠氮化合物等。但实践证明，这些诱变剂对植物虽有较强的诱变效应(如叶色改变、诱发白化苗等) ，但对有价值性状(如早熟性、抗病性、丰产性等)的诱发效果较差(包括遗传传递力差)。前人的研究认为，化学诱变频率受处理时间(作物不同的生长发育时期)和方法的影响很大。濮绍京等(2005)探讨了秋水仙碱诱变小豆的适宜浓度及处理时间，得出处理浓度对M1 世代出苗和成株率的直接影响明显大于处理时间。杨茂成等(1997)将萌发了4 d 的野生大豆种子经秋水仙素处理3 d 以后，根尖分生区细胞的超微结构发生了一些显著变化，这些细胞已具备了分化细胞的特征，而不再入于有丝分裂之中。蔡国海等(1992)在水稻、小麦和大麦上获得的多种类型有价值变异表明，秋水仙素是一种有效的化学诱变剂。

本研究采用0.2%和0.4%秋水仙素处理小豆干种子12 h，获得了丰富的变异类型，初步选得到了株高、株型、叶色、叶形、荚色、粒色和成熟特性等完全不同的突变体263株,但未获得加倍材料。王凤宝等(2009)用0.05%秋水仙素和2% DMSO 混合水溶液间歇处理宝峰2 号豌豆种子48 h，对处理的豌豆后代进行形态学和细胞学观察比较，发现了可育的同源四倍体。该同源四倍体与其二倍体在植株形态上的显著差异表现在：植株高大，茎和卷须变粗，单株总叶面积变大，叶色更绿，开花期延迟，花粉粒和花粉母细胞变大，荚大，自交结实，粒大。

研究中71.86%的突变体由0.4%秋水仙素处理所得，即处理浓度越大，变异率越高，变异类型越丰富，但在产量构成因素方面，以0.2%秋水仙素为最佳处理。由此认为，我们所采取的诱变浓度和方法用于小豆诱变育种和突变体获得，具有诱变效应强、基因纯合快、变异类型丰富等优点，获得的突变体为小豆功能基因研究和育种提供了宝贵的材料。

3材料与方法
3.1 材料与仪器
供试材料为小豆京农6 号(JN6)品种，由北京农学院作物遗传育种研究所提供。所用仪器为日本美能达照相器材株式会社生产的CR-200b 色彩色差计，该色彩色差计为扩散照明垂直受光(O/D)方式。L* 为明亮度指数，值越大表示越明亮；a*、b* 称为红色度和黄色度指数，分别用于表示小豆籽粒的红色和黄色程度，a*值越大表示色泽越红，b* 值越大表示色彩越鲜。

3.2 处理方法
试验于2006-2008 年在北京农学院试验田进行。试验设0.2%和0.4%两个处理，分别用这两种浓度的秋水仙素处理1 000 粒京农6 号(JN6)种子12 h，将处理种子播种于北京农学院试验田，行距40 cm，株距15 cm，双粒点播。生育期间调查出苗期、三叶期、开花期、结荚期、成熟期等，统计出苗率和成株率。成熟时全部收获，风干后室内考种，项目包括株高、分枝始节、分枝数、荚长、荚宽、单株荚数、单株粒数、百粒重、单株产量。所有数据通过SPSS 统计软件处理。

3.3 粒色测定方法
采用色彩色差计测定供试小豆的粒色，取部分粒色突变单株的籽粒，每株抽取饱满籽粒5 粒，每粒测3次，取平均值。

作者贡献
吴宝美是实验研究的执行人，刘红霞、赵波、佟星参与数据分析和论文初稿的写作， 赵清穆参与实验设计，万平是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由北京市教委科研计划面上项目(KM201010020004)、人才强教引进人才项目(PXM2007-014207- 04453)、拔尖人才项目(PXM2007-014207-021717)共同资助。作者感谢北京农学院小豆研究室雷广军师傅在本实验及材料种植过程中给予的帮助，感谢两位匿名的同行评审人的评审建议和修改建议。谨以此文纪念尊敬的金文林教授。

参考文献
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