含硫氨基酸在饲料植物中含量较少，特别是半胱氨酸和蛋氨酸，常成为第一限制性必需氨基酸。培育高含硫氨基酸的牧草品种是当前牧草品质改良的研究热点之一。百脉根(Lotus corniculatus L.)是多年生优良豆科牧草之一，但其蛋白质含硫氨基酸含量低(Mainieri et al., 2004)。因此，利用一些高含硫氨基酸蛋白基因，通过遗传工程手段来提高植物蛋白质中含硫氨基酸水平具有十分重要的意义。
目前已经从多种作物中分离得到富硫氨基酸的蛋白及其编码基因，如玉米(Zea mays L.)、水稻(Oryza sativa L.)、向日葵(Helianthus annuus)及豌豆(Pisum sativum L.)等。玉米醇溶蛋白(zein)是玉米种子中的主要贮藏蛋白质，可分为α-、β-、γ-和δ-zein等四种主要类型。其中β-、γ-和δ-zein富含蛋氨酸和半胱氨酸(Shewry and Casey, 1999)。γ-zein基因在模式植物拟南芥的叶片和根中可以稳定表达(Geli et al., 1994)。Bellucci等(2000)通过添加内质网引导肽序列(KDEL)来提高γ-zein在转基因烟草中的累积。zein基因也已在白三叶草(Trifolium repens L.)、紫花苜蓿(Medicago sativa L.)等牧草植物中成功表达(Sharma et al., 1998；Bellucci et al.,2002)，为增加牧草可食性组织的含硫氨基酸含量提供了途径，而zeolin基因是菜豆球蛋白(phaseolin)基因与部分γ-zein基因构成的融合基因。本研究通过分子克隆技术，构建了两个含硫氨基酸基因的植物表达载体，并分别转化豆科模式植物百脉根验证所构建植物表达载体的正确性和可用性，以期为豆科牧草品质改良奠定基础。

1结果与分析
1.1植物表达载体的构建
以质粒pDHA和pROK.TG1LK为模板，分别扩增zeolin基因和γ-zein基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增得到片段与估计的片段大小符合(zeolin基因约1 600 bp, γ-zein基因约720 bp)，如图1所示。用试剂盒回收纯化目的片段，连接到pMD18-T克隆载体上，转化大肠杆菌DH5α。从转化的平板上挑选白斑划线，初步筛选出带有插入片段的克隆。随机挑选抗性克隆提取质粒DNA，进行酶切鉴定，可以切出目的片段，如图2。用NcoⅠ和BglⅡ双酶切pMD18zeolin和pMD18zein，回收zeolin和γ-zein基因片段，将其与pCAMBIA1302的大片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，命名为pCBzeolin和pCBzein。经NcoⅠ和BglⅡ双酶切质粒pCBzeolin和pCBzein检测证明zeolin和γ-zein基因片段已经插入表达载体pCAMBIA1302 (图3A)。将鉴定好的菌液送往中国农业科学院重大科学工程开放实验室测序，结果表明插入的目的基因与zeolin和γ-zein基因序列一致。
采用冻融法将pCBzeolin和pCBzein导入农杆菌LBA4404感受态细胞。小量提取质粒DNA，进行PCR鉴定后(图3B; 3C)，准备转化百脉根。
 

图1 zeolin和γ-zein基因的扩增 Figure 1 Amplification of γ-zein and zeolin genes

图2 中间载体的酶切鉴定 Figure 2 Restriction analysis of the middle vectors

图3 重组质粒pCBzeolin和pCBzein酶切及转化农杆菌的鉴定 Figure 3 Restriction analysis of recombinant plasmid pCBzeolin and pCBzein and PCR detection of plasmid DNA from transformed strain LBA4404.

 1.2外源基因转化百脉根
百脉根子叶用pCBzeolin/LBA4404和pCBzein/LBA4404浸染，共培养3 d后，转置筛选培养基。40 d后诱导分化出具有抗性的不定芽(图4A)，抗性芽的平均诱导率为3.2%，对照(在LBA4404中浸泡过的百脉根叶盘)逐渐褪绿、白化，不能诱导分化出不定芽(图4B)，说明选择基因潮霉素(Hyg)得到了正确表达并且显示了其应有的作用。将得到的抗性芽移至生根培养基(MSB+0.1 mg/L IBA+25 mg/L Hyg+200 mg/L Cef) (图4C)。完整植株进行温室盆栽，最终获得9株抗性再生植株，且形态特征正常(图4D)。
 

图4 百脉根转化植株分化与再生 Figure 4 Differentiation and regeneration of transformed L. corniculatus

1.3抗性植株的PCR检测
用zeolin (P5, P6)和γ-zein (P7, P8)基因的一对引物，分别对转化植株及非转基因植株总DNA进行PCR扩增，结果显示转化zeolin基因的再生植株均可扩增出890 bp左右的预期片段，4株转化γ-zein基因的抗性植株中有3株扩增出大小为290 bp左右的预期片段，非转基因植株均未扩增出任何条带(图5; 图6)，初步说明目的基因已整合到百脉根基因组中。
 

图5 zeolin基因转化百脉根植株的PCR鉴定 Figure 5 PCR analysis of zeolin gene from transformed L. corniculatus

图6 γ-zein基因转化百脉根植株的PCR鉴定 Figure 6 PCR analysis of γ-zein gene from transformed L. corniculatus

1.4抗性植株的RT-PCR检测
用Trizol提取转基因百脉根和非转基因百脉根的总RNA为模板，进行反转录得到cDNA。用其特异引物进行PCR检测，转化zeolin基因百脉根RNA反转录产物可扩增出890 bp左右的特异性条带，4株转化γ-zein基因百脉根中有3株的RNA反转录产物扩增出290 bp左右的特异性条带，非转基因百脉根的RNA反转录产物未扩增出相应条带(图7; 图8)，进一步证明外源基因zeolin和γ-zein已经整合到百脉根基因组中，并可以在转基因百脉根中正常转录。

图7 zeolin基因转化百脉根植株的RT-PCR鉴定 Figure 7 RT-PCR analysis of zeolin gene from transformed L. corniculatus

图8 γ-zein基因转化百脉根植株的RT-PCR鉴定 Figure 8 RT-PCR analysis of γ-zein gene from transformed L. corniculatus

1.5转基因植株含硫氨基酸含量分析

表1 转基因百脉根中含硫氨基酸的含量比较 Table1 Comparison of the content of sulphur-containing amino acid of transgenic L. corniculatus

由表1可知，转zeolin基因百脉根中的蛋氨酸含量极显著高于转γ-zein基因植株和非转基因植株中的含量(P<0.01)，转γ-zein基因百脉根和非转基因植株中的蛋氨酸含量无显著差异；转基因百脉根和非转基因植株中的胱氨酸含量无显著性差异(P<0.05)。转zeolin基因百脉根中含硫氨基酸的总量极显著高于转γ-zein基因植株和非转基因植株中的含量(P<0.01)，转γ-zein基因百脉根和非转基因植株中含硫氨基酸总量无显著差异，表明zeolin基因能更有效地提高百脉根中含硫氨基酸的含量。

2讨论
植物表达载体的构建，由于目的片段的长度(约1.6 kb和0.7 kb)以及其两端需要引入表达载体的酶切位点NcoⅠ和BglⅡ，应避免使用Taq酶，因其在PCR产物3′末端添加一个突出A，从而造成移码。本研究使用Ex Taq，具有3′→5′校读功能(王涌鑫和李聪, 2008)，能很好地按照设计扩增出我们所需要的目的片段。测序结果表明，即使采用了保真性较好的Ex Taq，PCR过程中仍发生错配。因此，选择具有高度保真性的PCR聚合酶非常必要，这与刘玲丽等(2004)的研究结果相一致。
豆科牧草百脉根易于培养和再生，是研究外源基因转化、牧草品质改良的模式植物(王广立等, 1994)。本试验选择以百脉根作为转化受体，将pCBzeolin/LBA4404和pCBzein/LBA4404导入百脉根基因组，检验所构建的植物表达载体的正确性和可行性，并为三叶草、紫花苜蓿等豆科牧草的转化和品质改良提供了技术支持。经过潮霉素的筛选培养，诱导再生得到了抗性植株，通过PCR检测证明了γ-zein基因和zeolin基因的存在。通过RT-PCR进一步证明了γ-zein基因和zeolin基因已分别整合到百脉根基因组中，并在转录水平上得到了正确表达。

含硫氨基酸有蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸三种。本研究中γ-zein基因和zeolin基因编码的蛋白富含蛋氨酸和半胱氨酸，在样品的前处理过程中半胱氨酸易氧化转变成为胱氨酸(刁其玉, 2007)，因此在含硫氨基酸分析中胱氨酸含量表示半胱氨酸和胱氨酸的总量。氨基酸结果分析表明，在转zeolin基因植株中蛋氨酸含量及含硫氨基酸总量极显著地高于转γ-zein百脉根中的含量(P<0.01)，而转γ-zein百脉根与非转基因百脉根中含硫氨基酸含量无显著性差异，表明与zeolin基因相比，γ-zein基因在百脉根植株中的表达量低。有研究报道，在转基因植物中各种为基因表达的时空专一性所必需的顺式序列和反式作用因子，在单子叶植物和双子叶植物之间它们是不同的(马荣才和李季伦, 1993)。由此我们推测，γ-zein基因在百脉根中的表达量可能与双子叶植物中的反式作用因子不能正确识别单子叶植物中的调控序列有关，从而影响其表达。此外转基因是插入到核基因组中，其表达量较低、且不太稳定，目前转基因叶片中含硫氨基酸蛋白的最高表达量仅有0.1%~0.8%，还未达到实际的营养价值1%~5% (Bellucci et al., 2000)。目前已有研究者将这些基因插入到叶绿体基因组中表达，由于叶绿体基因组是母性遗传的，并具有DNA的多拷贝数和特殊细胞结构等优点，有可能大大地增加外源基因的表达量，使转基因产物得到稳定高效地表达(杨宗岐等, 2007)。

3材料与方法
3.1植物材料
百脉根“里奥”(Lotus corniculatus L. “Leo”)由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草遗传育种实验室提供。

3.2质粒及菌种
本实验中使用的大肠杆菌(E. coli)菌株为DH5α (天根公司)，克隆载体为pMD18-T (TaKaRa公司)；根癌农杆菌菌株LBA4404、植物表达载体pCAMBIA1302均由本实验室保存。质粒pROK.TG1LK和pDHA为意大利CNR的Michele Bellucci博士惠赠。

3.3工具酶及主要试剂
各种限制性内切酶、LongAmp Taq酶、T逆转录酶、Oligo(dT)15 Primer及DNA片段回收试剂盒购自美国Promega公司，dNTP、DNaseⅠ、Ribonulease Inhibitor和Ex Taq为TaKaRa公司出品，其余常规药品均为进口或国产分析纯级。

3.4外植体培养
百脉根基本培养基是MS盐+B5维生素(MSB培养基) (Aoki et al., 2002)，pH 5.8。
挑选饱满的百脉根种子，用75%酒精振荡30 s，无菌水冲洗3次，再放入0.1% (HgCl2 +SDS)溶液振荡灭菌8~10min，无菌水冲洗4~6次，灭菌滤纸吸干水分，接种于MSB培养基。取7~10 d的无菌苗子叶(3~5 mm2)作为外植体，用于再生芽诱导。培养条件为光照周期14 h/d，光照强度2 000 Lx，培养温度25±1℃。

3.5植物表达载体的构建
用碱裂解法制备模板DNA，zeolin基因引物：
P1：5′-GGTTTGACCATGGGCATGATGAGAGCAAGGGTTCCACTCC-3′，NcoⅠ；
P2：5′-TAAAAAATAGATCTACCATCTGGCACGGGCTTGGATGCGGCTGTTG-3′，BglⅡ。
γ-zein基因引物：
P3：5′-ATAAAAATACCATGGGCATGAGGGTGTTGCTCGTTGCCCT -3′，NcoⅠ；
P4：5′-CGCCTATCAGATCTACCATTAGCTCATCTTTCTCACTAGTGTGGGG-3′，BglⅡ。
引物由Invitrogen公司合成。采用50 μl反应体系，含PCR buffer 5 μL，0.2 mmol/L dNTP，上下游引物各0.4 μmol/L，模板DNA 0.5 μg，Ex Taq 1 U。PCR扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 3 min，3个循环；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 3 min，5个循环；94℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 3 min，30个循环；72℃ 10 min。目的条带经胶回收纯化后，连接到pMD18-T载体上，转化感受态细胞DH5α。重组质粒分别命名为pMD18zeolin和pMD18zein。
将重组质粒pMD18zeolin和pMD18zein进行NcoⅠ和BglⅡ酶切，回收目的片段(zeolin基因和γ-zein基因)，插入到经NcoⅠ、BglⅡ酶切的植物表达载体pCAMBIA1302中，转化感受态细胞DH5α，提取质粒，进行酶切鉴定，并将经过鉴定的表达载体分别命名为pCBzeolin和pCBzein (图9)。

图9 植物表达载体pCBzein、pCBzeolin的结构图 Figue 9 Schematic maps of plant expression vectors pCBzein and pCBzeolin

采用冻融法将pCBzeolin和pCBzein导入LBA4404菌株。提取质粒DNA，进行PCR扩增鉴定。

3.6外源基因转化百脉根
挑取含有外源基因质粒的农杆菌LBA4404单菌落，接种到20 mL含有链霉素(Str, 50 mg/L)和硫酸卡那霉素(Kan, 50 mg/L)的液体LB培养基中，28℃振荡培养过夜；将培养物于3 500~4 000 r/min离心10 min收集菌体，用MSB液体培养基重悬，28℃继续培养至OD600值为0.4~0.6。将无菌苗子叶在农杆菌菌液中浸染5~10 min后，置于无菌滤纸上吸去附着的菌液，转入共培养培养基，25℃暗培养3 d，接种至筛选培养基上进行抗性芽的诱导分化。
共培养培养基：MSB+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA+100 mg/LAS；筛选培养基：MSB+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+50 mg/L Hyg+500 mg/LCef。

3.7转化植株的PCR检测
采用CTAB方法提取百脉根转化植株的基因组DNA，并以此DNA为模板。根据zeolin基因和γ-zein基因序列设计PCR引物，zeolin基因引物：
P5：5′-AACTCTGACAACTCCTGGAACACT-3′；
P6：5′-GTAGCCTTGATGGCAACTGG-3′。
γ-zein基因引物：
P7：5′-CCACCATGCCACTACCCTACTCAACC-3′；
P8：5′-GGACTGGAGGACCAAGCCGAAGAT-3′。
以未转化的植株作为阴性对照，以质粒pCBzeolin和pCBzein作为阳性对照。PCR扩增反应程序为95℃ 5 min；95℃ 10 s，53℃ 30 s，65℃ 1 min，45个循环，65℃ 10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离。
1.7.2转化植株的RT-PCR检测
利用TRIzol提取百脉根转化植株和非转化植株的总RNA，进行反转录得到cDNA。用zeolin基因(P5, P6)和γ-zein基因(P7, P8)引物进行PCR检测和电泳分析。逆转录反应体系为25 μL，含模板RNA 2 μg，Oligo(dT)15 Primer 1 μL，M-MLV Reaction Buffer 5 μL，dNTP (10mmol/L) 5 μL，Ribonuclease Inhibitor 1 μL，M-MLV RT 200 U，加DEPC水补足25 μL。

3.8转基因植株含硫氨基酸含量的测定
在植株现蕾期，取转基因百脉根植株和非转基因植株茎上部的茎叶，烘干，粉碎，氧化水解，上机测定，含硫氨基酸分析(仪器为岛津LC-10A高效液相色谱)由农业部饲料工业中心进行。用SAS9.0进行数据分析(周霞等, 2006)。

致谢
本研究由国家十一五科技支撑计划(2006BAD01A19)和新疆农业大学草地资源与生态自治区重点实验室开放课题(XJDX0201-2005-03)资助。

参考文献
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