在东北地区大豆生产中，低温播种常常会造成种子发霉腐烂，低温下出苗也多为弱苗，严重影响了大豆产量。鉴定和筛选低温下出苗率高的大豆品种对东北地区大豆育种及生产具有十分重要的意义。然而，由于大豆的耐低温性状是一个由多基因控制的数量性状，在不同植物和不同生育期，耐低温性状往往由不同的基因控制。多年的实践证明，应用常规遗传育种方法进行耐低温育种非常困难。

目前，对苗期耐低温QTL (quantitative trait locus)的研究主要集在水稻(Oryza satiua) (林静等, 2010;刘之熙等, 2010, 杂交水稻, 24(3): 233-236;聂元元, 2011)中、番茄(Solanum lycopersicum) (刘冰等, 2010)和马铃薯(Solanum tuberosum) (单友蛟, 2010)中，芥菜(Brassica juncea)(周贤达, 2010)中也有相应的报道。但是对大豆耐低温QTL定位的研究相对较少。Ikeda等(2009)利用重组自交品系(recombinant inbred line, RIL)群体的F₅和F₆代在A2连锁群上定位到一个与大豆低温相关的Sat_162位点；Funatsukid等(2005)利用RIL群体F₆代定位到3个低温条件下影响大豆产量的QTLs；蒋洪蔚等(2009)利用大豆导入系进行了耐低温芽期鉴定，共定位到12个相关QTLs；胡国玉等(2008)获得2个与大豆耐低温出苗性状相关的SSR标记位点Satt562和Satt157。

回交导入系(Backcross Introgression Lines, BILs)，又称近等基因系(Near Isogenic Lines, NILs)。Tanksley和Nelson (1996)提出高代回交育种(Advanced Backcross QTL analysis, AB-QTL)策略，将QTL定位推迟到较高回交世代(如BC₂, BC₃等)，使得育种材料背景比较纯合，因而能检测到指定背景材料下影响目标性状的QTL，这种方法将QTL定位和有利基因的导入相结合，既发掘了特定背景下可以通过分子标记辅助育种的QTL，又为育种实践创造了材料基础。

本研究利用高代回交导入系红丰11×Harosoy群体BC₂F₄代进行苗期耐低温的鉴定和筛选，在分子水平对筛选的超亲个体进行基因型分析和QTL定位，实现了传统育种和分子标记的结合，为进一步探究耐低温遗传机制以及找到与耐低温相关的稳定遗传位点奠定了基础。

1结果分析
1.1超亲个体及供体等位基因导入频率分析
本研究共筛选到在苗期低温条件下明显优于轮回亲本红丰11的45株超亲个体。从346对差异引物中，选择多态性较好且覆盖20个连锁群的51对进行多态性分析。卡方检测的预期值为BC₂理论比例值(0.125)。由于我们进行定向选择，与随机群体相比较，选择群体供体导入频率的卡方值和平均值均具有一定程度的偏离，但是变化程度并不是很大(表1)。 

表1 BC2F4代红丰11×Harosoy群体苗期耐低温导入系供体等位基因频率及其偏离 Table1 Frequency and deviation of donor alleles in BC2F4 lines from the population of Harosoy×Hongfeng 11 for low-temperature tolerance at seedling stage

1.2卡方检测定位QTLs
根据供体导入频率相应位点在苗期耐低温选择群体和随机群体中的总体表现，利用卡方作近似检测(域值为(P<0.05)。共检测到分布于10条连锁群上13个区域的供体导入频率呈现显著变化(表2; 图1)。即C1、D1b、D2、E、F、H、I、K和M连锁群上的Satt338、Sat_192、Satt041、Satt271、Satt669、Satt651、Satt663、Satt142、Satt440、Sat_020、Sat_244、Satt336和Satt540。其中，11个苗期耐低温位点的有利等位基因来自于红丰11，仅Satt041和Sat_020有利等位基因来自于供体亲本Harosoy，它们的加性效应分别是2.50和0.53。 

表2卡方测验检测苗期耐低温QTLs Table 2 QTLs of low-temperature tolerance detection by chi-square test at seedling stage

图1大豆苗期耐低温QTLs位点在连锁群上的分布 Figure 1 Distribution of QTLs related with low-temperature tolerance at seedling stage in different linkage groups

1.3方差分析定位QTLs
通过对低温条件下低温反应指数与基因型的方差分析(域值为P<0.05)，检测到1个位点，即分布于D1b连锁群上的Satt041 (表3; 图1 D1b)，遗传贡献率为8.58%，其有利等位基因来自于供体亲本Harosoy。Satt041也是由上述两种方法共同定位到的，是大豆苗期低温条件下定位到的可信位点。

表3方差分析检测苗期耐低温QTLs Table3 QTLs of low-temperature tolerance by ANOVA analysis at seedling stage

2讨论
2.1影响供体等位基因导入频率的因素
多态性标记数量会影响等位基因导入频率的检测效率，在本研究的群体组合中，可能存在等位基因频率的估计偏差较大，即原始群体耐低温的表现可能直接受供体等位基因导入频率高低的影响。

尽管基因型可以对选择起作用(Jannink and Walsh, 2002)，但定向选择对等位基因导入频率也有重要的影响，具体体现在两个方向极值的增加和整体导入频率的提高/降低，极大值可达到随机群体的几倍或几分之一，原始群体的背景效应无法完全解释这种现象；一些标记本身往往不与性状相关，但根据遗传搭车(Genetic Hitch-hiking) (Smith and Haigh, 1974; Barton, 2000)原理，可通过检测相关标记的供体等位基因导入频率的偏离，初步筛选选择群体中进行目标性状位点，因目标性状的选择不同，检测效果也会有不同，这说明选择的效果同目标性状的复杂程度相关，即简单性状对等位基因导入频率偏离的程度效果更直接。为此，我们选取了均匀分布于各连锁群的引物进行SSR扩增，尽可能地减小这些偏差。

2.2利用两种遗传分析方法进行QTL分析
由于导入系群体经过选择后，会导致等位基因偏离、群体规模小，无法进行传统作图分析。因此本研究利用2种分析遗传方法，对耐低温苗期导入系进行了QTL分析。

基于遗传搭车的等位基因导入频率偏离检测，可以在回交群体的当代检测有利等位基因的导入情况，对材料选择的目的性和准确性更强，能有效地获得优良材料并初步定位选择响应相关的位点。其检测效果也因选择的目标性状而有所不同，这表明选择效果与性状复杂程度有关，即简单性状对等位基因导入频率偏离的程度更加准确、直接。

运用表型与基因型相结合的方差分析，一方面能发现一些对选择没有直接响应、导入频率变化不显著从而被卡方检测所漏检的位点，另一方可以再次验证卡方检测的结果，排除由于遗传基因漂变或个别标记偏分离而偶然形成的偏离位点；此外，要使方差分析的检测达到较高的显著水平，群体中需存在大量的表型变异。

从理论上说，由于选择群体规模通常较小，完全解不能通过基因型-表型线性方程而求解，本研究中相关位点的表型效应的不完全解主要基于单位点模型的方差分析而获得，属有偏估计，仅仅适用于QTL初步分析；同时，高代回交选择的株系中存在少部分的杂合子(小于1.5%)。因此更加适用的解析方法和遗传模型是后续研究的重点。

2.3 QTL定位结果的一致性
本研究所用的两种分析方法定位到的与大豆苗期耐低温相关的13个QTL，与以往的研究相比，它们具有更好的一致性。本研究定位到的与耐低温苗期相关的标记Satt540，与蒋洪蔚等(2009)的研究中被定位到的一致。C1连锁群上的Satt338是在耐盐条件下定位到的与发芽指数相关的位点(邱鹏程等, 2011)；D1b连锁群上的Satt271是在耐盐条件下定位到与发芽率相关的位点，而在本研究中，其与大豆苗期耐低温密切相关。本研究不但得到以往与耐低温相关的一致性位点，还得到了与耐盐条件下相同的位点，这将为进一步研究大豆各性状间的遗传重叠打下基础。本研究中，两种方法定位到的位点重叠程度较小，可能存在的原因是：一些方差分析检测到的位点，无法利用简单的表型选择通过改变群体的基因频率来加以改良(郑天清等, 2007)；也有可能是重叠基因座的基因效应方向不一致造成表型效应的相互抵消。

本研究结合两种遗传分析方法，在高代回交选择育种群体中进行QTL定位分析，与传统方法相比，既减小了分子标记的工作量，又很好地将遗传与育种研究结合起来，初步形成了分子辅助育种的检测平台。本文初步报道了高代回交导入系应用在耐低温苗期的研究，后续的实验仍在进行之中；这些在耐低温苗期检测到的相关位点，将为耐低温苗期的分子机理研究打下基础，同时也为耐低温各个时期QTL的累加提供优良的标记信息。

3材料与方法
3.1大豆导入系材料构建
本研究以中国农业科学院作物科学研究所提供的美国品种Harosoy (供体)和黑龙江省农垦科研育种中心提供的红丰11(受体)为亲本，构建了红丰11×Harosoy回交导入系。以红丰11为母本受体与供体杂交获得杂种F₁代种子，F₁代植株再与红丰11回交获得BC₁F₁代种子，然后将其进行自交获得BC₂F₃世代材料。分别随机选取BC₂F₃世代两个群体的种子500粒，经芽期耐低温鉴定筛选后，得到的BC₂F₄世代材料，然后进行苗期耐低温的鉴定；从BC₂世代的群体中，分别随机选取50粒种子组成随机对照群体。本实验所用的群体构建于2004～2010年。

3.2苗期耐低温材料的鉴定筛选
分别选取2亲本(Harosoy和红丰11)种子20粒种于育秧盘中，25℃光照培养，待两片真叶完全展开后，对第1组进行8~10℃低温处理，第2组继续在正常条件下生长。7 d后，将幼苗恢复正常生长，量取低温胁迫前后2组幼苗的株高，并计算低温反应指数(Low-temperature Response Index, LRI) (Han et al., 2004; 郑天清等, 2007)，以红丰11为对照。其中，将这2个指标均优于对照组的材料视为超亲材料，将超亲材料移入盆栽，进行繁殖后，收获种子。


3.3等位基因导入频率分析
利用SSR标记分别对选择群体及BC2随机群体的供体导入频率进行分析，公式如下(与轮回亲本一致的基因型记A, 与供体亲本一致的基因型记B, 杂合基因型记H, 缺失或模糊记C)：


3.4卡方检测
卡方分析基于“遗传搭车”(genetic hitch-hiking)效应(Harr et al., 2002)，即根据群体遗传学原理，当群体中与选择相关的等位基因被替代，由于选择压力的作用，有利基因及其连锁位点频率上升，而不利基因及其连锁位点下降的现象。利用获得的基因型数据对供体导入频率与随机群体的偏离情况进行差异显著性检测，以卡方测验作显著性检测，显著水平为0.05，自由度为1，卡方值计算应用卡方校正公式，如下：

将本实验中的数据带入后，公式如下(a: 选择群体供体导入频率; b: 选择群体受体导入频率; c: 随机群体供体导入频率; d: 随机群体受体导入频率)：


3.5 方差分析
方差分析基于表型和基因型相结合，利用耐低温选择群体的基因型数据，结合相关性状的调查数据，采用SAS PROC GLM的单向方差分析(ANOVA)，检测QTL及其贡献率，以P<0.05显著水平作为临界值。
贡献率的计算公式为:

(α_i: 单位向量; λ_i: 原指标相关系数矩阵相应的特征值)。

加性效应值的计算参考了Zang等(2008)在水稻遗传重叠研究中加性效应的计算方法，加性效应是指受体等位基因被供体等位基因替代后的效应。某一抗逆位点在抗逆指标上的加性效应计算公式为(供体组均值-受体组均值)/2。
                                                     
作者贡献
张闻博、邱鹏程是本研究的实验设计执行人并完成数据分析，论文初稿的写作；张振宇参与实验研究；刘春燕、蒋洪蔚及李灿东参与实验设计；陈庆山、胡国华是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改，是本文的责任作者(通信作者)。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由黑龙江省高校青年学术骨干支持计划项目(1152G007)资助。

参考文献
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