超长链单不饱和脂肪酸(VLCFAs)在生物体中起着综合的作用，是三酰甘油、膜脂、鞘脂的必要生物成分，也是蜡质层复合物的前体(Lee et al., 2009)。VLCFAs的生物合成由脂肪酸酰基辅酶A延长酶(FAE)催化完成，FAE是一种膜结合酶复合物，包括3-酮脂酰辅酶A合成酶(KCS)，3-酮脂酰辅酶A还原酶(KCR)，β-羟脂酰-CoA脱水酶(HCD)和反式烯脂酰(ECR) (倪郁和郭彦军, 2008; Joubès et al., 2008)。在所有植物及微生物的脂肪酸延长酶系统中都普遍存在着以上四种酶，但KCS基因起着关键的作用(杨慧等, 2012)。

KCS基因最早在拟南芥中鉴定(Rossak et al., 2001)，之后在芸苔属芥菜、油菜，油蜡树属的霍霍巴(Blacklock and Jaworski, 2002)，旱金莲属旱金莲(Mietkiewska et al., 2004)等植物中都获得KCS基因。研究表明，有些植物的KCS基因表达增加了长链脂肪酸的含量。2009年，Guo等将银扇草KCS基因在转基因拟南芥中表达，种子油脂肪酸成分分析表明神经酸的含量增长30倍，相似的转基因实验使埃塞俄比亚芥种子油中神经酸的含量增长7~10倍。拟南芥KCS基因在强半乳糖诱导型启动子调控下，在酵母转化株中积累了20:1、22:1以及24:1的脂肪酸，这些在非转化酵母培养物中不存在(Millar and Kunst, 1999)。本研究中根据已获得的植物中的KCS基因的序列，在大豆基因组(http://www.phytozome.net/soybean)上同源搜索大豆KCS基因，克隆该基因，并进行生物信息学预测分析，旨在为该基因结构和功能的进一步研究提供理论依据。

1结果与分析
1.1大豆KCS基因序列的克隆
在公布的大豆基因组序列中，根据其他植物KCS基因的氨基酸序列，搜索得到的大豆KCS基因的序列位于大豆基因组第14条染色体的6112931至6114767序列之间。根据该序列设计引物D1和D2，以大豆叶片总RNA为模板，RT-PCR扩增获得约1 500 bp的条带(图1)。将该片段连接到pMD18-T载体上，获得重组质粒pMD18-T-KCS。将其转入大肠杆菌中，提取质粒进行鉴定，用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，得到与预期相符的片段(图1)。利用DNAMAN软件，将测序结果与大豆基因组上该段序列进行同源性比对，同源性达到100%，说明该段序列(图2)扩增正确，且在不同大豆品种间的该基因无差别。由图2可知，大豆KCS基因的CDS全长为1 533 bp，编码的蛋白质具有510个氨基酸，序列数据已经登录(GenBank accession No. JX855159)。
 

1.2大豆KCS基因的生物信息学预测
用Protparam得知，该蛋白的分子量57.1 KD，等电点(pI)为9.03，带正电残基(Arg+Lys)总数为56，负电残基(Asp+Glu)为45，总的亲水性平均系数为0.035，预测该蛋白属于疏水性蛋白。其氨基酸组成见表1。
 

表1 大豆KCS编码蛋白的氨基酸组成 Table 1 The amino acid composition of KCS encoding protein of soybean

通过TMHMM对大豆KCS编码的蛋白进行跨膜区预测，结果如图3所示。该序列包含6个跨膜区，只有TM1和TM2完全跨膜，分别位于第43~65，77~99氨基酸残基之间；利用SignalP4.0预测得知，大豆KCS编码的蛋白不存在信号肽；用Prodictprotein预测蛋白的二级结构表明，此蛋白的α螺旋占47.65%，无规则卷曲占35.88%，β折叠占16.47%。

利用MEGA5.05构建KCS家族的蛋白质序列系统进化树，家族中各成员的进化关系如图4所示，结果表明大豆KCS和油茶的KCS的亲缘关系最近，来自于同一个分枝，其次是菟葵、苜蓿，来自同一个次分枝。从该图中可以看出，根据KCS构建的系统进化树中，比较符合传统的系统分类，玉米和小麦在同一个次分枝，同属禾本科植物；花生和棉花来自同一分枝，都属于油料作物；银扇草、水芹、海甘蓝、拟南芥、芥菜、独行菜、小果亚麻芥和亚麻芥来自同一分枝，都属于十字花科植物。
  

图4 大豆KCS与其它KCS的进化树分析 Figure 4 Phylogenetic relationships between KCS from soybean and other KCS proteins

2讨论
KCS基因在调控长链脂肪酸合成中起着关键的作用，在多种植物中发现并克隆，但大豆KCS基因的获得鲜有报道。本文利用同源搜索克隆了大豆KCS基因的序列，并通过生物信息学相关软件对该基因编码蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构域、蛋白质二级结构及系统进化等方面进行预测，这些初步预测的结果有助于有目的性的进行该基因所编码蛋白的功能研究。

研究表明某些植物的KCS基因表达主要集中在种子中(Mietkiewska et al., 2004)。本文中根据KCS构建系统进化树的植物来自于豆科植物、主要的粮食作物、油料作物及含有较高浓度的芥子油的十字花科植物，因此KCS基因极可能在这些植物种子长链脂肪酸的积累中具有重要作用。由图4结果可知，多数已知植物的分类符合传统的系统分类，说明该进化树的构建合理。

 KCS基因的表达主要集中在种子中，而且有些植物的KCS基因的启动子是种子特异性启动子(Rossak et al., 2001; Guo et al., 2009)，大豆KCS基因的表达方式的研究，及其启动子的调控特性(即是否具有种子特异表达的特性)，也将是进一步研究的方面。

3材料与方法
3.1供试材料
大豆品种吉豆2号、大肠杆菌DH 5α为本实验室保存；限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ、pMD18-T克隆载体、ExTaq、T₄连接酶、RNAiso Reagent试剂盒、逆转录试剂盒均购自Takara公司，DNA凝胶回收试剂盒购自维特洁公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成，其他试剂均为进口或国产分析纯。

3.2大豆KCS基因序列的克隆
利用RNA提取试剂盒提取大豆叶中的总RNA，以提取的总RNA为模板，按照逆转录试剂盒的说明合成大豆cDNA的第一条链。根据已获得的植物中的KCS基因的氨基酸序列(拟南芥AL023094.2, 苜蓿XP_003606927.1, 花生AC251240.1, 棉花ABA01490.1, 银扇草EU871787.1)，在大豆基因组序列(http://www.phytozome.net/soybean/)中，同源搜索大豆的KCS基因序列。根据该基因的序列，设计引物(D₁: 5'-ATGACAGTGACGATGAGTGGA-3'; D2: 5'-CTATGAGAC-TATTTCCACAGGATAC-3')，RT-PCR扩增大豆KCS基因序列。反应条件为预变性95℃ 5 min；94℃ 30 s，51℃ 40 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃后延伸7 min。将PCR扩增片段连接到pMD18-T克隆载体上，获得重组质粒并进行测序。

3.3大豆KCS基因的生物信息学分析
利用ExPASy Proteomics Server (http://expasy.org/tools/protparam.html/)在线软件预测蛋白基本理化性质；利用TMHMM Server v.2.0、SignalP4.0、Prodictpro- tein分别预测可能的跨膜结构域、信号肽和蛋白质的二级结构；应用多序列比对工具ClustalX，以氨基酸全序列联配的结果为基础，采用 MEGA5.05软件包中的邻接法构建系统发育树。

作者贡献
赵艳是本研究的实验设计和实验研究的执行人；邱增成和翟莹参与实验设计和实验结果的分析；徐红红和国春晖参与基因的克隆工作。全体作者都阅读并同意最终的本文。

致谢
本研究由黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12521611)、作物生物学国家重点实验室开放基金资助(2012KF13)和齐齐哈尔大学青年教师科研启动支持计划项(2010K-M09)共同资助。

参考文献 
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Guo Y., Mietkiewska E., Francis T., Katavic V., Brost J.M., Giblin M., Barton D.L., and Taylor D.C., 2009, Increase in nervonic acid content in transformed yeast and transgenic plants by introduction of a Lunaria annua L. 3-ketoacyl- CoA synthase (KCS) gene, Plant Mol. Biol., 69(5): 565-575

Joubès J., Raffaele S., Bourdenx B., Garcia C., Laroche-Traineau J., Moreau P., Domergue F., and Lessire R., 2008, The VLCFA elongase gene family in Arabidopsis thaliana: phy- logenetic analysis, 3D modelling and expression profiling, Plant Mol. Biol., 67(5): 547-566

Lee S.B., Jung S.J., GoY.S., Kim H.U., Kim J.K., Cho H.J., Park O.K., and Suh M.C., 2009, Two Arabidopsis 3-ketoacyl CoA synthase genes, KCS20 and KCS2/DAISY, are fun- ctionally redundant in cuticular wax and root suberin biosynthesis, but differentially controlled by osmotic stress, Plant J., 60(3): 462-475

Mietkiewska E., Giblin E.M., Wang S., Barton D.L., Dirpaul J., Brost J.M., Katavic V., and Taylor D.C., 2004, Seed-speci- fic heterologous expression of a nasturtium FAE gene in Arabidopsis results in a dramatic increase in the proportion of erucic acid, Plant Physiol., 136(1): 2665-2675

Millar A.A., and Kunst L., 1999, The natural genetic variation of the fatty-acyl composition of seed oils in different ecotypes of Arabidopsis thaliana, Phytochemistry, 52(6): 1029-1033

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