豇豆(Vigna unguiculata (L.) Walp.) 是日常食用 最广的蔬菜品种之一，具有理中益气、补肾健胃、和五脏、调营卫、生精髓。广泛分布在热带、亚热带地区，在我国栽培历史悠久。豇豆也是海南农民喜欢种 植的反季节蔬菜，种植面积约 22 000 ha，特别是海南的南部地区。

枯萎病是豇豆生产上发生的一种重要的土传病害，在海南豇豆种植区常有发生。由于复种指数大，抗病品种较少等原因，豇豆枯萎病的发生与危害越发严重，常造成死株，影响产量和品质，是制约豇豆规模生产的主要病害之一。对于豇豆枯萎病的研究，国内文献报道不多。吴仁锋(2012, 湖北大学学报, 34(1): 100-103)对武汉市豇豆枯萎病分离后鉴定为尖孢镰刀菌，潘虹等(2011)对尖孢镰刀菌亚麻专化型进行了生物学特性研究。笔者2014年在海南乐东一豇豆地分离采集到病原菌分离物，经致病性测定，可致豇豆引起枯萎病， 对其生物学特性进行了研究，现将结果报道如下。

1结果与分析

1.1病原菌的分离与形态特征

 对田间采集到的病样经常规组织分离，通过培养、纯化，获得尖孢镰刀菌菌株。在 PDA 培养基上 28℃培养，菌落近圆形，气生菌丝白色絮状或粉绒状，培养基表面紫红色，背面深紫色，菌株菌丝浓密， 呈同心轮纹，质地厚实，气生菌丝茂盛。大型分生孢子镰刀形或略弯曲，顶细胞渐尖并弯曲成喙状，基细胞足状，多数为 3 隔，少数 4~7 隔，大小为 16.8~42.5 um× 3~5 um。小型分生孢子无色，椭圆形，单胞或具 1 分隔，大小 5~14.8um×2.2~5um。分生孢子梗瓶状突 起，厚垣分生孢子顶生或间生，圆形或椭圆形(图1)。 这与吕佩珂(1992, 农业出版社, pp.118)对豇豆尖孢镰刀菌枯萎病菌的描述较一致，而与本文作者赵志祥(2013)报道的海南薯蓣茎腐病病原菌尖孢镰刀菌 薯蓣专业化型未见厚垣孢子有差异，这可能与不同作物或病原菌的培养时间有关系。

图 1  豇豆枯萎病菌株的形态

1.2 病原菌致病性测定

用病菌孢子悬浮液处理过的豇豆，初期病株下部叶片先变黄，逐渐向上发展，叶片干枯、脱落，剖开病株根茎基部，内部维管理束组织变褐，植株枯萎，而对照植株不发病(图 2)。对发病植株进行镜检和再次组织分离，获得的菌株与接种的菌株形态一致，证明分离物即为豇豆枯萎病的病原。

图 2 枯萎病菌接种豇豆的致病性测定

1.3 rDNA-ITS 的扩增

如图3 A所示，提取和纯化的病原菌基因组总DNA大于23 kb，条带清晰，说明DNA浓度较高，适合后续 PCR 反应。将其稀释 10 倍后，用真菌 rDNA-ITS区的通用引物ITS1和ITS4 PCR扩增，扩增产物经1%琼脂凝胶电泳检测，可扩增出条带约为650 bp 目的片段(图 3 B)。

图 3 豇豆枯萎病菌基因组DNA 及ITS 扩增

1.4 ITS 同源性分析

测得的序列在NCBI中在线去除载体序列后，得到全长为569bp的ITS序列，和Blast比对发现：其与已报道的菜豆尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum (AB705144))序列相似性高达99%；与其它尖孢镰刀菌序列相似性均在97%以上。下载相似性最高的多条序列，与该豇豆病原菌一起，用MEGA 4.0软件采用 Neighbor Joining rNJ 法 Complete Deletion 模式构建系统进化发育树，并分析系统进化发育关系(图 4)。

图 4 豇豆枯萎病菌ITS系统进化发育分析

从图 4 中我们也能清晰的看到，该病原菌与菜 豆尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum (AB705144))聚在 同一分支上面，遗传距离最近。这也说明了豇豆枯萎病的病原为尖孢镰刀菌 菜豆专化型 (Fusarium oxysporum f. sp. phaseolus)，这与吴仁锋等(2012, 湖北 大学学报, 34(1): 100-103)报道一致。

1.5 病原菌生物学测定

1.5.1温度对菌丝生长速率的影响

从图 5 可见，在所试温度下，4℃时生长较缓慢， 37℃生长不好，50℃不生长，其它温度下豇豆尖孢镰刀菌菌丝生长较好，适宜生长温度为 20~30℃，最适温度为 25℃。

图 5 温度对菌丝生长的影响

1.5.2 pH 对菌丝生长的影响

由图 6 可见，豇豆尖孢镰刀菌菌丝在 pH 为 4~12 范围内均能生长，适宜 pH 为 6~10，最适 pH 值 8.0， 嗜好碱性条件，即适应碱性的环境较酸性环境强。

图 6 pH对菌丝生长的影响

1.5.3 光照对菌丝生长速率的影响

从图 7 和表 1 可见，持续光照下菌丝生长最好， 其次是全黑暗，但两者间无显著差异，而光暗 12 h 条 件下生长最慢，且菌丝稀疏，与上述两处理差异达显著水平。

表 1 不同光照处理对豇豆尖孢镰刀菌菌丝生长的影响

图 7 光照对菌丝生长的影响

1.5.4 不同碳源、氮源对菌丝生长的影响 

由表2可知，供试的6种碳源中，以果糖、D-甘露醇为碳源的培养基上生长速度较快，在LSD0.01水平上无显著性差异；而以葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和可溶性淀粉为碳源的培养基上生长相对缓慢。而供试的6种氮源中，以蛋白胨为氮源的培养基上生长最快，然后依次为硝酸钠、硝酸钾、氨基乙酸、牛肉浸膏和酵母浸膏。其中酵母浸膏在 p=0.01的水平上与其 它5种氮源相比，差异达显著平。

表 2  不同碳源处理对豇豆尖孢镰刀菌菌丝生长的影响

2讨论

海南近年来豇豆种植面积不断扩大，2013年约占瓜菜类种植面积的 11%，占豆类种植面积大于70%，而豇豆枯萎病田间发病率一般 5%~20%，严重时30%以上，甚至绝收。本研究对采自海南豇豆病原菌分离物经 形态学观察、致病性测定和ITS序列分析，鉴定该病原 菌为尖孢镰刀菌菜豆专化型(Fusarium oxysporum f. sp. phaseolus )，这为该病害的致病分子机理及综合防治 研究提供了充分的背景资料和技术手段，同时也加 速了豇豆抗尖孢镰刀菌枯萎病品种的筛选和培育 的进程。

经对豇豆尖孢镰刀菌菜豆专化型生物学特性初步研究，菌丝适宜生长温度为20~30℃，与海南田间发病规律相吻合。适宜pH值6~10，嗜偏碱性，这与潘虹等(2011)报道的尖孢镰刀菌亚麻专化型适应碱性的能力较酸性强相一致，而据吕佩珂等(1992,农业出版社,pp.118)报道酸性条件利于分生孢子芽 管的生长。全光照和全黑暗有利于菌丝生长，与潘虹等(2011)报道全黑暗有利于尖孢镰刀菌亚麻专化型 菌丝生长稍有差异，这可能与不同作物病原菌、不同区域或品种等有关。生产上豇豆枯萎病与豇豆茎基 腐烂病表面上症状相似，两者都造成豇豆萎蔫，但前者造成维管束褐变，后者不造成维管束褐变，同时豇豆枯萎病病原菌为尖孢镰刀菌菜豆专化型，豇豆茎基腐烂病原菌为瓜果腐霉，生产中要注意两者的区别(毛勇等, 2011)。通过对其生物学特性初步研究，表明温度、pH值及光照均能影响该病原菌菌丝的生长，影响菌丝生长和孢子生长的其它因素及发生规 律等的研究有待开展，希望相关工作能为致病机理和病害防治等研究提供理论基础。

3 材料与方法

3.1 病原菌分离及鉴定

3.1.1供试菌株来源

2014 年 3 月 13 日从海南省乐东县九所镇豇豆 地枯萎病发病样本上采集到，经常规组织分离和纯化培养后(方中达, 1998, 中国农业出版社, pp.122-124)， 纯化菌株保存于 4℃冰箱中备用。

3.1.2 病原菌形态观察

采集到的病样经保湿培养后用针轻轻挑取表面霉层，在显微镜下直接观察菌丝和孢子形态。病原菌在PDA上培养，待其长孢挑取菌丝制作临时玻片， 观察其形态特征。

3.1.3 病原菌致病性测定

盆栽豇豆待其长出 7、8 片叶时，用消毒过的针 刺伤根茎基部，然后配制供试菌株的孢子悬浮液(孢 子浓度约为 105~106 个 /mL)，用喷雾法将孢子悬浮液 喷到根茎基部，多余悬浮液浇灌豇豆根部，同时喷无菌水为对照。正常栽种管理，每隔1~2 d观察症状，发病后，从病株再次分离病原菌，确认致病菌。

3.1.4 病原菌 DNA 提取

将分离纯化的病原菌接种于 PDA 平板上 28℃培养 7 d后，用灭菌刮铲刮取菌丝，液氮中研磨成粉末。同时，分装到 2.0 mL 无菌离心管中，每管约 0.1~0.2 g，-20℃冰箱保存，备用。或者直接加上1 mL的DNA提取缓冲液，参考王会芳等(2012)的方法略 作修改，按北京三博远志生物技术有限公司生产的 真菌基因组 DNA 快速提取试剂盒使用说明提取并 纯化病原菌基因组总 DNA。

3.1.5 特异引物扩增 ITS 序列

以提取并纯化的病原菌基因组 DNA 为模板，经真菌 ITS 通用引物 ITS1 和 ITS4 PCR 扩增(刘春来等, 2007, 东北农业大学学报, 38(1): 101-106)。扩增 反应体系 50.0 uL，其中，10×Easy Taq Buffer 5.0 uL， 2.5 mmol/L dNTPs 2.5 uL，1 492r 5 pmol   (2.5 uL)，27f5 pmol (2.5 uL)，模板 1 mL (50 ng)，ddH2O 36.0 uL，Easy Taq DNA 聚合酶0.5 uL。反应条件为：94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，55℃退火 45 s，72℃，延伸 90 s， 32 个循环，72℃，延伸 10 min，4℃保存。取少量(约5 uL)扩增产物，经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测目的条 带的大小。引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，均由北京三博远志生物技术有限公司合成。 

3.1.6 纯化 PCR 产物、测序及比对

余下 PCR 扩增产物经胶回收，pEASY-T 载体连 接，Trans 5α转化涂板，蓝白斑筛选和菌液 PCR 验证 的阳性克隆送北京三博远志生物技术有限公司测序。 获得的序列在 NCBI 中比对搜索，确定种属，并下载 一致性较高的序列与上述菌株的 ITS 序列一起，采用 Mega4.0 软件生物信息软件(Tamura et al., 2007)， 以邻近距离法构建系统进化发育树，并分析系统进 化发育关系。

3.2  病原菌的生物学测定

3.2.1 温度对菌丝生长的影响

培养 5 d 后，从距培养皿边缘3 cm 处用无菌打孔 器打取直径为 5 mm 的菌块接种于 PDA 平板中央， 并放置于 5℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃和 50℃的 恒温培养箱中进行培养，每个处理 3 次重复，培养 6 d后，测量菌落直径(方中达, 1998, 中国农业出版社, pp. 140-142)。菌落直径(mm)=菌落测量直径(mm)- 菌块 直径(mm)。

3.2.2 pH 对菌丝生长的影响

调配 pH 值为 4、6、7、8、10 和 12 的 6 种PDA 培养基，倒培养基并制成平板，同一圈打取培养 5 d 直径为5 mm的菌块，28℃恒温培养 6 d 后再测量菌落 的直径。

3.2.3 光照对菌丝生长速率的影响

制作PDA平板并接种培养 5 d 直径为5 mm 的 菌块，同时放置于 24 h 全黑暗、24 h 全光照和光暗交替12 h 三种条件下 28℃培养箱中培养，6 d 后测量菌落的直径。

3.2.4 不同碳源、氮源对菌丝生长速度的影响

采用 Crapek 为基础培养基：NaNO3 2 g、KCl 0.5 g、 K2HPO4  1 g、FeSO4  0.01 g、MgSO4  0.5 g、蔗糖 30 g、琼脂 20 g、水 1 000 mL、pH 自然，然后再以相同碳量的可溶性淀粉、果糖、麦芽糖、葡萄糖及D- 甘露醇代替 基础培养基中的蔗糖作为试验碳源，配制成含不同 碳源的培养基。用以上 Crapek 为基础培养基，再分别以等氮量的硝酸钾、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏、氨基乙酸代替硝酸钠作为试验的氮源，配制成含不同氮 源的培养基。以上制作成平板后，接种培养 5 d菌龄的 菌块，置 28℃下培养 6 d，测量菌落直径。

作者贡献

 肖敏是本研究的具体执行者，负责试验的操作 和论文的撰写；赵志祥老师负责试验设计和论文撰 写修改；吉训聪研究员田间采集病样；曾向萍和严婉 荣进行生物学的研究；王会芳负责病原菌鉴定工作。

致谢

 本研究获得国家级及单位创新基金的支持，得到 海南省植物病虫害防控重点实验室大力资助，同时也 感谢本研究所其他同仁试验过程中给予的帮助。
 

参考文献

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