植物基因的表达与生物钟参与植物生长调控密切相关，植物的生物钟系统主要由生物钟输入部分，中央振荡器，生物钟输出部分和阀门效应器组成(李宗飞等, 2015)。前人研究表明，LHY和CCA1是一类R1类Myb类型DNA结合转录因子，LHY/CCA1和TOC1一起构成了拟南芥生物钟中央振荡器的核心调控环，TOC1首先正向第调控LHY/CCA1的表达，当LHY/CCA1达到一定的表达量，又会CCA1和LHY与TOC1启动子的黑夜元件(EE)相结合负向抑制TOC1的表达 (Harmer et al., 2000)，(Alabadí et al., 2001)。在白天，CCA1/LHY表达水平的降低可以逐渐解除其对TOC1的抑制作用，使得TOC1的mRNA表达量的增加。当TOC1的表达量达到一定量的时候，又会正向调控CCA1和LHY的表达，使得CCA1和LHY的表达量增加，从而形成了一个振荡的生理循环。

我们用生物信息学的方法在大豆中鉴定了4个LHY的直系同源候选基因。为了进一步验证我们进行生物信息学分析的可靠性和正确性，我们根据大豆中LHY基因的同源基因设计引物，用RT-PCR方法在大豆中扩增了一个全长cDNA序列，将该基因与我们根据生物信息学分析得到的4个GmLHY进行相似度比较并将该基因命名为GmLHY2。随后，我们将GmLHY2构建到PGEX表达载体，在BL21表达宿主菌中表达了GST-GmLHY2融合蛋白，并初步探索了GST-GmLHY2融合蛋白原核表达条件。

1结果与分析

1.1 LHY在大豆中的PCR扩增

利用所设计的2对特异引物对灰布支进行PCR扩增，第2对引物扩增得到一条特异扩增带，分子量大约2300 bp (图1, 图2)。

1.2 PCR产物的克隆

1.2.1扩增片段的回收

采用pMD18-T载体进行连接并转化人肠杆菌Gm109菌株，挑取阳性克隆，双酶切验证插入片段大小。

1.2.2阳性克隆的测序和in silico分析

挑取阳性克隆GmMYBLHY1测序，获得的克隆片段大小约为2252 bp，其中有一个全长为2250 bp的全长ORF，翻译成749个氨基酸序列的蛋白。将该序列和大豆LHY的4个同源基因进行氨基酸序列比对，发现它与GmLHY1、GmLHY2、GmLHY3和GmLHY4的相似性为依次为90.1%、98.1%、71.3%和71.4%。据此我们推断，我们克隆的是GmLHY2基因。

1.3 GmLHY2的原核表达

1.3.1表达载体的构建和转进BL21表达菌株

用根据PGEX表达载体设计的引物进行PCR，PCR胶回收后连接到PMD18-T克隆载体，转入Gm109克隆菌株，提取质粒后，双酶切鉴定后，与PGEX表达载体链接，再转入Gm109克隆菌株，试剂盒提取质粒，EcoRI与SaII双酶切鉴定(图3)，然后转入BL21表达菌株，PCR鉴定(图4)。

1.3.2 GST-GmLHY2 目的蛋白的时间梯度诱导表达

将鉴定过含有PGEX-GmLHY11的重组载体的宿主BL21菌株在28℃和37℃，IPTG浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μM的条件下诱导6个小时，结果表明，含有PGEX-GmLHY11重组载体的工程菌在37℃的条件下融合蛋白的表达效果要好于28℃，并且PGEX-GmLHY11工程菌在IPTG浓度为0.4 μM和0.6 μM条件下诱导效果较佳。选取1个表达较好的工程菌，在37℃，IPTG浓度为0.4 μM条件下，做时间梯度诱导(图5)，从图中可以看出，融合蛋白的分子量大于97 KDa。GmLHY2基因编码蛋白的有749个氨基酸，用相关的在线软件分析，其蛋白分子量大小为82 KDa，再加上GST编码的23 KDa的蛋白，其预期大小为105 KDa，而根据图中所示，融合蛋白的分子量大于预测，这有可能是以下几个原因：第一，蛋白大小的软件预测本身就不准确，第二，GST-GmLHY2蛋白在BL21宿主菌中表达后，发生了蛋白修饰作用，比如，糖基化，与自身或者其他蛋白形成了二聚体等。如果是第二种情形，这就会加大后续的纯化工作的难度。

2讨论

本研究根据大豆中LHY基因的同源基因设计引物，在大豆中成功了扩增了1个全长ORF为2250 bp的片段，翻译成749个氨基酸序列的蛋白。将该氨基酸序列和大豆LHY的4个同源基因进行氨基酸序列比对，发现它与GmLHY1、GmLHY2、GmLHY3和GmLHY4的相似性为依次为90.1%、98.1%、71.3%和71.4%，可见我们克隆的是GmLHY2基因。但是，我们克隆的GmLHY2基因与我们根据生物信息学分析得到的GmLHY2基因的相似性并不是100%，这可能是由于所用的大豆材料不同而造成的。

我们原核表达的融合蛋白的分子量要大于预测的分子量，这有可能是以下几个原因：第一，蛋白大小的软件预测本身就不准确，第二，GST-GmLHY2蛋白在BL21宿主菌中表达后，发生了蛋白修饰作用，比如，糖基化，与自身或者其他蛋白形成了二聚体等。如果是第二种情形，这就会加大后续的纯化工作的难度。

3材料与方法

3.1材料

大豆材料为高抗SCN的大豆品种灰布支(Glycine Max, 源自山西省兴县农家品种, ZDD2315)。本实验所用到的克隆菌株为E.Coli Gm109，无抗性；载体为pMD18-T，其抗性为Amp50 (50 μg/mL)；原核表达的宿主菌株为E.coli BL21，无抗性，表达载体为PGEX，其抗性为Amp100。所用的培养基为LB液体培养基(酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、PH为7.2)和LB固体培养基(LB液体培养基＋1.5% (w/v)琼脂)分别用于大肠杆菌的液体培养和固体培样。大肠杆菌感受态细胞的Inoue转化缓冲液(10.88 g MnCl_2, 2.20 g CaCl₂·H2O, 18.65 g KCl 溶于水, 加20 mL 0.5M PIPES (PH6.7), 再加ddH₂O至1 L, 经预先处理的Milipore滤膜(0.22 μm孔径)过滤除菌后分成小份于-20℃保存)。提取质粒DNA的溶液采用煮沸法配制(萨姆布鲁克J., 2002)。用于原核表达的溶液：将8 g IPTG (Sigma公司产品)溶于10 mL双蒸水中，0.22 μm 滤器过滤除菌，分装，-20℃保存得到IPTG贮存溶液(萨姆布鲁克J., 2002)。根据GST gene fusion system(Pharmacia Biotech, Inc, 29)等制备大肠杆菌 BL21 感受态细胞所需的TSS buffer。

3.2方法

3.2.1引物设计

根据GmLHY的4个同源基因设计1对引物，上海生工(Sangon)生物程公司合成：上游引物P1：5---TAATGGACGCCGACTCCTCT---3，下游引物P2：5---TCAAGTTGAAGCCTCCCCAT---3。

3.2.2大豆植株采样

取处于生长幼期的整株快速洗净，用锡纸包好，放入液氮中速冻2~5 min，-70℃保存备用。

3.2.3大豆基因组总RNA的提取

大豆总RNA的提取按照BioFlux公司的Biozol总RNA提取试剂盒的说明书进行。由于RNase存在的范围广泛，并且很难灭活。为防止RNase污染，凡与RNA操作有关的仪器用0.1%双氧水(H₂O₂)浸泡过夜，70℃烘烤2 h；再高压120℃灭菌30 min。将去离子水加入到经过无RNA酶处理的玻璃瓶中，加入DEPC至0.1% (v/v - DEPC/去离子水)，搅拌均匀后高压120℃灭菌30 min得到DEPC水。

3.2.4 cDNA第一条链的合成

准备的试剂：TakaRa公司的RNA kit (AMV) Ver 3.0 反转录试剂盒、Oligo dt-Adaptor primer、Mgcl2、5 X AMV Reverse Tra、RNase inhibitor、dNTP mixture、RNase Free dH2O，反转录步骤参照TakaRa公司的RNA kit(AMV)Ver 3.0 反转录试剂盒的说明书。

3.2.4目的基因的克隆

PCR扩增：将反转录产物稀释5倍，梯度PCR反应体系和程序、琼脂糖凝胶电泳参照(郭营, 2008)。PCR产物的回收：PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，将目的DNA片段在紫外灯下切下，用Fermentas life science 公司的DNA Extraction Kit试剂盒回收并纯化(如果不立即回收，可将切下的胶条放在1.5 mL离心管中，存于-20℃)，具体步骤参照Fermentas life science 公司的DNA Extraction Kit胶回收试剂盒说明书。 将纯化后的PCR产物连接到pMD18-T Vector (TAKARA公司)，按TAKARA公司的 pMD18-T Vector试剂盒说明书进行操作。转化过程取新制备的50 μL Gm109 感受态细胞，加入5 μL连接产物，混匀，冰上静置30 min；42℃热激1 min(精确计时)， 再冰浴2~3 min；加入300 μL37℃ 预热的LB 液体培养基，37℃剧烈震荡预培养1 h；取200 μL菌液，涂于含有50 mg/L 氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜；取出平板，4℃保存。提取质粒DNA，用SacI和SmaI。对重组质粒进行双酶切鉴定。酶切体系为：Buffer 1X Tango™：1.5 μL，SacI：0.5 μL，SmaI：0.5 μL，DNA：3 μL，ddH2O：9.5 μL，Total Volume：15 μL。混匀后，30℃ 水浴90 min，然后37℃ 水浴90 min；鉴定为阳性克隆的菌株，送往公司(上海生工)进行测序，所得克隆分别命名为GmLHY，菌株于-70℃保存。检出的阳性克隆由上海生工科技有限公司测序，测序结果用BioEdit进行拼接，翻译成氨基酸序列，并将核苷酸序列和氨基酸序列结果在NCBI数据库中进行相似性比对以及其他生物信息学分析。

3.2.5目的基因的原核表达

pGEX-GmR4g31重组质粒的构建根据GmLHY2基因的序列设计引物：上游引物(EcoRI)：5---GAATTCAATGGACGCATACTCCTC---3 ，下游引物(SaII)：5---GTCGACTCAAGTCGAAGTCTCC--- 3.以pMD18-T-GmR4g31为模板，进行PCR反应，退火温度为58℃，其他反应程序和体系同2.2.5.1。PCR产物做胶回收，再连接到pMD18-T载体，然后转入Gm109菌株。用菌液PCR鉴定后，用试剂盒提取pMD18-T-GmR4g31(加酶切位点)，利用EcoRI和SaII限制性内切酶对pGEX和pMD18-T-GmR4g31质粒进行酶切、收、连接，转化到大肠杆菌Jm 109中，并对重组质粒pGEX-GmR4g31进行了酶切鉴定。大肠杆菌BL21感受态的制备，将重组质粒pGEX-GmR4g31转进大肠杆菌BL21(刘大丽等, 2006)。GST-GmR4g31融合蛋白的小量诱导表达：将经过鉴定含有质粒pGEX和pGEX-GmR4g31的大肠杆菌BL21单克隆分别接种到含有100 mg L/Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；分别取200 μL过夜培养物，加入到含有100 mg L/Amp的2.8 mL LB培养基中，37℃振荡培养1 h，当菌液达到对数生长期(OD6oo=0.8-1.0)时，将菌液在37℃，28 ℃的温度下诱导培养，诱导物IPTG的浓度分别为1、0.5、0.2、0.1 mM。当菌液诱导至0 min、60 min、120 min、240 min、480 min、960 min时，收集菌液，13000 rpm /1sec收集菌液，加入PBST悬浮沉淀，再加入等量的2x SDS上样缓冲液，沸水浴5 min，13000 rpm /10 min离心。取20 μL上述样品进行SDS-PAGE电泳。电泳后，用考马斯亮蓝溶液进行胶染色。

作者贡献

李宗飞是本实验的执行人，负责实验设计、实施、数据分析及论文初稿写作；蔡梦蝶、刘振鹏、魏芳参与数据分析、初稿的形成、修改；方宣钧确定研究项目的构思、指导论文的写作及修改。全体作者阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由海南省热带农业资源开发利用研究所开放研究基金项目资助。

参考文献

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