钴(Cobalt, Co)是一种过渡金属元素，是多种生 物酶系统中的激活因子或组成元件(Paustenbach et al., 2013)，同时也是根瘤菌、自生固氮菌以及蓝藻细菌生 长的必要条件(Riley and Dilworth, 1985)。中国大部分土壤中 Co 含量为 5~40 mg/kg，平均的Co含量背景值为 11.6 mg/kg (魏复盛等, 1991)，部分地区土壤中 超过背景含量的Co是造成重金属污染的原因之一。 生长基质中微量的 Co 可刺激海藻及高等植物生长，高浓度的Co对植物存在毒害作用，主要表现为：(1)地上部分生物量降低(Talukder, 1994; Chatterjee and Chatterjee, 2000; Keeling et al., 2003; Li et al., 2009)、 叶片脱落、叶脉脱色、Ⅱ型叶绿素的合成受到抑制 (Kapustka et al., 2006; Sree et al., 2015)、叶片生长提前 关闭以及影响植物根系生长(Ghodake et al., 2011)；(2) 影响植物代谢关键生物酶活性(Talukder, 1994; Chat terjee and Chatterjee, 2000; Sree et al., 2015)；(3)影响 植物细胞内氧化还原内稳态、抗氧化酶活性(Chatter- jee and Chatterjee, 2000)。如何降低重金属Co对植物 的毒害作用，已成为近年来的研究热点。

本研究中考察了根际促生菌(plant growth-prom- oting bacteria, PGPB)的接种对钴胁迫下紫花苜蓿生长的影响。PGPB可以在环境胁迫条件下通过多种方式促进植物生长(Farwell et al., 2007; Glick et al., 2001; 赵丽红等, 2008; Buysens et al., 1996; Hao et al., 2010)。 在促进植物生长的同时，PGPB 可提升植物对Co胁迫的耐受能力 ，如赵丽红等 (2008) 克隆 IaaM 基因 (IAA 合成途径中的色氨酸单加氧酶)和ACC脱氨酶基因，并通过转基因操作转化进入矮牵牛，可在126 μmol/L Co 胁迫下保证转基因植株的生根，以及在 168 μmol/L Co 胁迫下保证转基因植株地上部分的 生长。虽然已经获得多种根际促生菌微生物可提升植物重金属耐受性的正向结果(Ma et al., 2011)，但其作用机制的揭示尚需更多研究结果。

研究中选择的紫花苜蓿尿黑酸叶绿醇转移酶(HPT)基因，编码生育酚合成途径限速关键酶—尿黑酸植基转移酶，在苜蓿生育酚合成途径中负责将植基二磷酸(PDP)底物转化为 2- 甲基 -6- 植基苯醌 (MPBQ)，进而生成生育酚的前体，是生育酚合成途 径 5 种关键酶之一(Penna and Pogson, 2006)。有报道在大豆和拟南芥的转基因试验中，转入HPT 基因后，种子中生育酚的分别提升至 1.4 倍和 1.8 倍(Savidge et al., 2002; Collakova, 2003; Karunanandaa et al., 2005)，拟南芥叶片中的生育酚含量达到了对照植株的4.4 倍(Savidge et al., 2002; Collakova, 2003; Karunanan-daa et al., 2005)。由于生育酚在植物生理生化反应中承担了抗氧化和光合保护的功能(Welch, 2003)，有报道生菜材料在多种胁迫条件之下，如强光、干旱、低温及脱落酸等激素诱导之下，HPT 基因转录表达均 显著提高。如 2011 年任薇薇博士论文报道使用农杆菌渗入法进行HPT基因瞬时表达后，HPT基因上调至对照的 12.47 倍。将HPT基因作为研究目标，目的在于考察紫花苜蓿生育酚合成途径在 Co 胁迫条件下及根际促生菌接种后，是否同样具有明显的调控趋势。目前根际促生菌-紫花苜蓿形成的共生体系在土壤重金属修复中具有广泛的应用。研究可初步 揭示促生菌提升植物耐受能力的作用机制，对促生菌的筛选和对土壤重金属生物修复，具有重要的理论意义。

1结果与分析

1.1 Co胁迫对紫花苜蓿的毒害作用分析

萌发60 d后采集紫花苜蓿，发现在接种促生菌 的植株根部形成根瘤组织，而对照植株根部无根瘤出现，显示促生菌在植物中已正常接种。根据植物材 料株高与生物量统计结果(图 1)，在没有CoCl₂ 条件下，根际促生菌的接种并未对株高和生物量产生明 显影响；而在 100 mg/L 的 CoCl₂ 溶液处理后，不同菌 株处理的植株之间在株高和生物量上出现了明显差 异：(1)部分植株株高和生物量均出现明显降低。CK 植株平均株高为 18.66 cm，处理后降低至 13.36 cm； 降幅最大的为接种 Sinorhizobium meliloti 菌株的植 株，平均株高从19.51 cm降至12.30 cm。在生物量上，CK植株生物量均值在胁迫前为0.356 g，胁迫后降为 0.204 g；降幅最大是接种 Sinorhizobium meliloti 菌株的植株，生物量均值在处理前为 0.349 g，处理后 降为 0.119 g, 降幅高于 CK 植株。(2)相比 CK 植株， 接种 Pseudomonas aeruginosa 1401和 Pseudomonas maltophilia 1402菌株植株的株高和生物量下降幅度 更小。其中接种 Pseudomonas aeruginosa 1401 的植株，在 Co 胁迫后，平均株高分别为 18.82 cm，生物量 均值分别为 0.395 g，生长状况明显优于同样胁迫条 件下的 CK 植株，已与未胁迫的 CK 植株无明显差 异。数据显示促生菌 Pseudomonas aeruginosa 1401 的 接种可降低 Co 对紫花苜蓿的毒害作用，相对于CK 植株，分别株高和生物量提高了 40.87%和 93.63%。

1.2模板来源及浓度检测

研究中使用的植物cDNA 模板处理方法(表 1)， 所有模板均为反转录体系稀释10倍获得，微量检测 后发现浓度均位于5~10 mg/mL 之间，PCR模板符合实验要求。

1.3引物扩增效率及特异性检测

备选内参基因 Real time PCR溶解曲线显示只 有单一主峰，凝胶电泳检测 PCR 扩增产物结果显 示：只有特异性扩增条带，无其它杂带，且片段大小 与目的条带一致，说明所设计引物特异性良好。通过效率检测发现引物扩增效率均在 90%~110%之间， 相关系数均大于0.99 (表 2)，设计引物符合实验要求。

1.4备选内参引物的平均表达水平

对备选内参基因进行比较 Ct 值法发现，备选基因中18S 的Ct 值范围最低，其次为 actin2 基因。观察发现 GAPDH 基因和 UBI 基因在 Co胁迫环境中Ct值下降明显，显示出更低的表达水平。考虑到在Co胁迫下，植株内的氧化胁迫势能增加，必然对参与葡萄糖酵解途径等有氧代谢产生较大的影响，GAPDH 基因的表达将受到抑制；其次，Co胁迫会带来细胞内多种蛋白酶活性的丧失，细胞代谢水平降低，因此参与泛素化修饰的UBI 基因的表达也将受到影响。备选内参基因的Ct值均集中在25~35之间(图2)。基因的Vn/n+1 均小于 0.15，综合考虑实验成本和操作，确定使用 2 对内参基因18S 和actin2。

1.5内参引物的软件筛选

使用在线分析内参引物工具 refFinder (http://www.leonxie.com/referencegene.php)对备选内参基因的表 达稳定性进行分析。根据四种算法(Comparative ΔCt, BestKeeper, NormFinder 和 geNorm) 的比较( 图3A~图3D)，最终筛选获得 Co 胁迫中内参基因表达稳定 性的顺序：18S>actin2>UBI>MSC27>GAPDH>EF1-α(图3E)。使用geNorm软件分析，确定内参引物的数量(图 4)。检测标准为当 Vn/n+1≤0.15,则可使用 n 个引物 组合进行定量检测。结果中发现顺序选择备选内参基因的 Vn/n+1 均小于 0.15，综合考虑实验成本和操作，确定使用 2 对内参基因 18S 和 actin2。

1.6 HPT 基因表达调控分析

图 5 展示了 HPT 基因在接种 PGPB 前后的转录 调控趋势。以 actin2 和 18S 为内参检测样本中尿黑 酸植基转移酶编码基因(HPT)的表达水平。从结果中可知：(1)当 PGPB 接种紫花苜蓿后，植株的HPT转 录水平有较大的提升，提升最高的是接种 Rhizobium sp.1305 的植株中，HPT 转录水平达到了 CK 植株的13.91 倍。(2)紫花苜蓿处于 100 mg/L Co 胁迫时，CK 植株的 HPT 基因表达水平下降至对照的 27%。由于HPT基因编码生育酚合成途径关键限速酶，其转录水平的大幅度降低会导致植物生育酚合成量下降，从而影响植物抵抗氧化胁迫的能力(Collakova and Della, 2001)。(3)接种 PGPB 后的植株，其 HPT 基因的转录水平在受 Co 胁迫后明显高于 CK 植株。其中接 种 Pseudomonas aeruginosa 1401 和 Stentrophomonas maltophilia 1402 的植株在 Co 胁迫条件下，HPT 基因转录水平分别是同等条件下 CK 植株的 6.63 倍和9.03 倍。

研究中对其他生育酚合成酶(HPPD 基因, TC 基 因, γ-TMT 基因)的转录水平进行了分析，在 Co 胁 迫后均呈现明显上调的趋势(数据未显示)。紫花苜 蓿生育酚合成途径中仅 HPT 基因会因 Co 胁迫表达 下调，HPT 基因有较大可能是 Co 对植物产生毒害作 用的靶标分子。

2讨论

Real time PCR 技术在植物关键调控基因表达研究中的应用广泛，为配合该技术的使用，需要筛选特定条件下合适内参基因。原因是不同环境中持家基因的表达水平差异极大(Pombo-Suarez et al., 2008; Infante et al., 2008)，而且不同的金属元素胁迫下，持家基因的表达水平也不尽相同。已有报道分别在Zn 胁迫条件和 Cu 胁迫条件下，天蓝苜蓿的内参基因选择各有差异(孙亚丽等, 2014; 张德辉等, 2015)。本研究中选择 6 个持家基因中，Co 胁迫下18S 和 antin2 的内参稳定性较好，而对 GPRDH 等基因影响较大，说明 Co 毒性作用偏向于抑制细胞代谢过程，对核基因组和细胞骨架形成的影响较小。 联系HPT基因表达(图 5)与株高 / 生物量(图 1)的数据可发现：(1)在常规条件下，接种 PGPB 的植株与CK 相比的 HPT 基因转录水平明显增大，接种 Rhizobium sp. 1305 菌株植的 HPT 转录水平上调 至 CK 植株的 13.91 倍，但株高与生物量都与 CK 持平。考虑到紫花苜蓿等高等植物对抗氧化胁迫至 少具有两套体系—生物酶系统和非酶系统，生育酚只是非酶系统的作用成分之一。非胁迫环境下生育 酚和抗氧化生物酶通过共同作用来维持植物机体 环境的氧化还原内稳态，生育酚水平在植株维持氧 化还原内稳态的过程中并非主导地位。同时，生育酚的合成也受到其底物络氨酸合成途径的影响，生育酚合成途径中单独HPT 基因表达上调会受限于底物不足，生育酚合成量提升的幅度有限。(2)在 Co 胁迫环境中，CK 植株HPT基因表达水平的调控趋势和植物生长表现具有一致性。研究中在 Co 胁迫 条件下，HPT 基因转录水平最高的三种植株样本， 同时也是株高和生物量表现最优的前三位植株；反之，HPT 基因表达最低的植株，包括CK 与 Sinorhi- zobium meliloti 接种植株，其株高和生物量均明显低于HPT 基因高表达植株。由于HPT 转录水平较高的植株可合成更高水平的生育酚(Savidge et al., 2002; Collakova, 2003; Karunanandaa et al., 2005)。 在对抗 Co 胁迫的过程中，这些植株可展现出更好 的耐受性。

3材料与方法

3.1植物材料

供试材料为休眠级 8 级“游客南方型紫花苜 蓿”，购自百绿集团。4 度春化后置于发泡椰糠砖 (121℃灭菌 2 h)中萌发。萌发后第 3 天、第 5 天和第 7 天分别使用 1 mL 的 PGBP 菌液进行接种。分别使用 1/2 MS 培养基和含 Co 培养基(含 100 mg/L CoCl2) 1/2 MS 进行培养。培养条件为照度 2 000 Lx，白天24℃×14 h，夜间 20℃×10 h，湿度 50%。萌发后 60 d采集植物材料，统计植株的株高和生物量，每种处理 设 10 个生物学重复。

3.2菌株材料

选取 4 种根际促生菌株接种苜蓿材料(表 1)，菌株均为本研究所在胁迫环境中筛选获得的植物促生菌株。

3.3 RNA 提取及cDNA的合成

植物萌发 30 d 后，采集植株地上组织液氮碾磨， 使用 Bio-Rad 微量 RNA 提取试剂盒提取植株总RNA，使用 iScript cDNA Synthesis Kit 合成,第一链 cDNA，操作均参照试剂盒说明。使用 Snapdrop100 仪器检测 cDNA 模板浓度。

3.4引物设计与验证

选取 6 个持家基因(表 2)作为备选内参基因：(1) actin2，编码细胞骨架结构蛋白；(2)GAPDH，编码 3- 磷酸甘油醛脱氢酶；(3) UBI，编码泛素链接酶；(4)18S，编码核糖体蛋白；(5) MSC27，参考 Kakar (2008)的引物设计；(6) EF1-α，编码真核延伸因子。使用 Prime Primer 5.0 进行引物设计，引物合成由英潍捷基 (上海)贸易有限公司完成。

引物扩增效率及特异性分析参照张德辉等(2015) 方法。检测仪器为 CFX 96TMRealtime System (Bio-Rad) 荧光定量 PCR 仪。PCR 体系 10 μL，程序为 2× Sso- fast Premix 5 μL，模板 0.2 μL，引物各 0.5 μL，ddH2O 3.8 μL；Real-time PCR  程序为 95℃ 30  s，95℃ 5  s， 60℃ 5 s，50 个循环，65℃至 95℃，每隔 0.5℃溶解 曲线分析。使用 CFX96 内置软件计算各引物标准曲线的斜率和扩增效率 E。通过溶解曲线检测内参 引物特异性。

3.5内参引物的筛选

使用 Graphpad Prism6 对备选内参 Cycle thresh- old (Ct)值进行分析。备选内参引物表达稳定性分析 参照张德辉等方法(Zhang et al., 2015)。检测 cDNA 模板(1~2)中备选内参基因的表达稳定性 PCR 体系和 PCR 程序与 3.4 相同，所有处理均设置 3 个重复。

3.6 HPT 基因表达调控分析

根据蒺藜状苜蓿尿黑酸叶绿醇转移酶编码基因(GenBankNo.AY957391.2)序列设计引物，正向引物HPT702F：5'-AGGGACGGCTTATTCCATCA-3'，反向引物 HPT988R：5'-AATACCCGCTTCTGACCTAAAC-3'。以筛选内参基因为参照，按照 3.4 中方法进 行反应，检测表 1 中 cDNA 模板(1~10) HPT 基因的 相对表达水平。

作者贡献

刘绵学、伏毅是本研究的实验设计和实验研究 的执行人；王艳和谢艳参与了研究中的植物栽培工作；黄敏指导了论文修改。全体作者都阅读并同意最 终的文本。

致谢

本研究由四川省科技厅科技支撑计划项目(2012FZ0078, 2015SZ0209)资助。

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