花生是中国食用植物油和风味食品的重要来源之一。在种子干重中籽粒含油量约占44.27%~53.86%，其中花生油的主要脂肪酸是油酸和亚油酸。花生油脂的氧化稳定性和营养价值主要由油酸/亚油酸比值(油亚比, O/L)决定(Bolton and Sanders, 2002)。油酸属于单不饱和脂肪酸，是十八碳单烯酸，有助于人体内低密度脂蛋白胆固醇(LDL)的含量的降低；并能维持人体内高密度脂蛋白胆固醇(HDL)的含量，有利于人体的心血管健康，因此油酸含量高的油也被称为营养保健油。影响花生制品贮存期的重要因素是油酸/亚油酸(O/L)的比值，高O/L的花生贮存期长且不易氧化和腐败；而低O/L的花生制品和花生油在保存时很容易发生酸败，存放时间长则会产生有毒物质，危害人们的生活健康。因此，衡量花生品质性状的重要指标是O/L值，提高花生籽粒的O/L值是花生品质改良的主要目标。

控制籽粒油酸、亚油酸含量和O/L比值的关键酶是 Δ12脂肪酸脱氢酶(delta 12 fatty acid desaturase, FAD2)。FAD2催化油酸在碳12 位上脱氢引入第二个双键生成亚油酸，控制籽粒中油酸和亚油酸的含量及比值(Jung et al., 2000a; Lopez et al., 2000)。产生高O/L比花生的主要原因之一是由于FAD2酶活性的丧失(Jung et al., 2000a)。栽培种花生属于异源四倍体，花生中 FAD2是由 AhFAD2A 和 AhFAD2B 这 2 个不同基因组上的同源非等位基因共同调控编码， 这2个基因的DNA序列在编码区有99%的相似，分别位于花生的 A 基因组和 B 基因组(Jung et al., 2003)。 Lopez 等(2001)研究表明花生高油酸性状是由2对隐性基因的加性效应控制的。Jung 等(2000b)研究验证了控制高油酸性状的 ol1 位点和 ol2 位点分别编码花生的AhFAD2A 和 AhFAD2B 基因的可能性。这两 个基因的同时突变引起酶活性的变化导致高油酸性 状的产生。

高油酸花生突变体主要是FAD2A基因序列的第448 bp位置由碱基A取代原来的碱基G，引起错义氨基酸使天冬酰胺替代天冬氨酸(D150N)，在FAD2B (FAD2B 441_442insA) 441与442位置中插入一个1 bp的A碱基，导致一个移码即三联体密码的阅读方式改变；即花生高油酸基因型是由 AhFAD2A 的448 bp 的点突变(G448A)和 AhFAD2B 突变(441~442 位点插入A 或插入1个205 bp 的反向重复序列)共同调控的(Lopez et al., 2002; Patel et al., 2004)。在酵母体系的基因突变和基因表达中被测定证实出，高的去饱和酶活性的油酸突变体明显低于正常油酸花生基因型酶活性(Yin et al., 2007; Yu et al., 2008)。这些高油酸突变体可为高油酸新品种的培育提供宝贵的实验材料。

本研究利用AS-PCR检测不同花生材料的AhFAD2基因型，结合其含油量及O/L值，分析基因 型与表型之间的联系，旨在为更好地选育优质、高油、高油亚比花生品种奠定基础。
 

1结果与分析

1.1花生AhFAD2基因型的测定

在 AS-PCR 检测中，实验所采用的12个花生材料经PCR反应均产生预期的1.2 kb 的参照带(图1) 和目标条带，根据各个反应的 PCR 结果能够准确地检测出每个花生材料的 FAD2A/FAD2B 等位基因和基因型。

图 1 PCR琼脂糖凝胶电泳产物带

1.2 AhFAD2 基因型与 O/L 值之间的关系

oll 和ol2 两个隐性非等位同源基因共同调控花生 高油酸的产生。具有活性的 AhFAD2A 和 AhFAD2B 分别是由OL1和OL2 编码的。ol1 是 AhFAD2A 的一个隐性突变等位基因，能导致其编码的酶功能降低或丧失活性；ol2是AhFAD2B 的隐性突变等位基因， 它的改变导致 AhFAD2B不能编码正常有活性的蛋白。花生高油酸的基因型是 ol1ol1ol2ol2；而普通油酸的显性纯合基因型是  Ol₁Ol₁/Ol₂Ol₂(Chen et al., 2010)。 结合这些花生材料的基因型(表1)和相应花生籽粒的O/L值分析，基因型为 Ol₁Ol₁/Ol₂Ol₂的五份材料(1514, 606, 9102, 614 和 1474)的油亚比都低于2.0，属于低油亚比材料；基因型为ol1ol1/Ol2Ol2 的四份材料(1586, 1513, 1476 和花 17)的油亚比均处于 2.0~5.0，属于中油亚比材料；基因型为ol₁ol₁/ol₂ol₂  的三份材料(1504,1505和1515)的油亚比均高于5.0，属于高油亚比材料。由此可见花生的AhFAD2基因型与油亚比 之间存在一定的关联。双显性纯合基因 Ol₁Ol₁/Ol₂Ol₂即常规油酸花生的显性纯合子表现为低油亚比，因为AhFAD2控制其编码的酶蛋白活性不受抑制，即Δ12 脂肪酸脱氢酶酶活性不丧失，能正常催化油酸在碳12位上脱氢及在油酸中引入第二个双键生成亚油酸，则籽粒中亚油酸含量相对增多，导致油酸和亚油酸的比值相对较低。双隐性基因 ol₁ol₁/ol₂ol₂ 即双突变体花生的纯合子表现出高油亚比 ，AhFAD2A和AhFAD2B基因的同时突变使其编码的酶蛋白活性降低或功能丧失，引起 Δ12 脂肪酸脱氢酶酶结构、酶活性或表达调控的变化，不能催化油酸脱氢生成亚油酸，共同导致高油酸性状的产生。而只有一个AhFAD2A基因突变产生的基因型 ol₁ol₁/Ol₂Ol₂则表现为中油亚比，亚油酸含量高于常规油酸纯合子，又低于双突变高油酸隐形纯合子，说明了高油亚比性状的产生需要AhFAD2A和AhFAD2B基因的同时突变，单独一个等位基因突变所产生的效果不如等位基因同时突变的效果明显。

表 1 花生不同基因型的油亚比和含油量性状

1.3 O/L 值与含油量之间的关系

在12份实验材料中，平均含油量56.67%，其中3 份是基因型为 ol₁ol₁/ol₂ol₂ 的花生材料中，平均含油 量56.90%，油亚比平均为 11.24，并且油酸含量均高于70%，其中基因型为 ol₁ol₁/Ol₂Ol₂有4份，油酸含量低于 70%的材料。在5份基因型为 Ol₁Ol₁/Ol₂Ol₂的材料中，含油量平均56.54%，油亚比1.28。卡方测验结果P=0.846 5表明，实验材料的含油量和油亚比之间的没有特定的关联。通过 O/L值与含油量的相关性分析其相关系数为0.124 948 38 (表 2)，也说明O/L值与含油量之间没有显著的正相关，表明油亚比与含油量之间没有特定的关联。

表 2 O/L值与含油量之间的相关性分析

2讨论

花生高油酸性状由两队隐形基因 ol₁ 和 ol₂ 共同调控，种子高油酸(油酸含量高于70%)性状的产生是由AhFAD2A和AhFAD2B基因共同突变导致的。在普通油酸含量(油酸70%以下)的花生资源材料中仅存在AhFAD2B的野生型基因(AhFAD2B-wt)，但同时存在 AhFAD2A 基因的野生型或突变型(AhFAD2A-wt 和 AhFAD2A-m)等位基因的分离(Chu et al., 2007)。前人研究表明，AhFAD2A-m突变基因的存在总是存在着油酸含量的相对提高，表现为中等油酸含量在55%~70%的中等油酸性状(雷永等, 2000; 丁锦平等, 2007; 周丽侠等, 2011)。目前研究表明AhFAD2A和 AhFAD2B基因共同调控着花生种子中油酸和亚油酸的含量及比值，至于在调控油酸含量中的相对贡献目前尚无确切定论，Jung等(2000b)认为在野生型花生材料中AhFAD2A或AhFAD2B基因任何一个有活性就能促使种子中油酸到亚油酸的正常转化， 表现为普通油酸性状。

综合AhFAD2基因型、O/L 值和含油量之间的相关分析，发现基因型的改变引起O/L值的变化，但与含油量的改变没有特定的相关性。等位基因双突变产生的高油亚比材料含油量均较高。本研究可以得出AhFAD2基因型与O/L值的高低有着直接的关联，但与花生含油量之间的相关性不显著，也表明等位基因单一突变效果不如双突变对不同花生基因型O/L值的影响大，但还不能说明AhFAD2A与AhFAD2B基因的单一突变效应及其活性对O/L比值的影响。该研究结果为亲本及后代的选择更有科学性，提高高油酸花生新品种选育效率。

3材料与方法

3.1试验材料

选材取于河南农业大学自选的品系，不同O/L值花生材料分别为：1504、1505、1515、1586、1513、1476、1514、606、9102、614、花 17和1474。

3.2 DNA提取

12份参试材料统一种植在玻璃器皿中，于恒温培养室培养，待种子萌发出苗后取每个材料未展开的小叶2~4片。采用常规 SDS-酚/氯仿法提取花生叶片DNA，将幼嫩的花生组织叶片置于研钵中，加入液氮研磨成白色粉末后加入2.0 mL离心管中；加入800 μL 1%的SDS基因组DNA提取缓冲液，摇床5 min；取出后加入 800 μL 25:24:1，摇床 5 min；12 000 r/min，离心 10 min；吸上清500 μL 左右，并加入等体积异丙醇，上下颠倒2 min 后于-20℃静置5 min 沉淀；12 000 r/min 离心10 min弃上清；75%酒精洗涤1次后再加纯酒精洗涤 1 次；晾干后加灭过菌的蒸馏水溶解DNA；紫外分管光度计下测 DNA 的浓度和纯度。

3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA

配置1%琼脂糖凝胶，在取5 μL DNA的PCR反应物原溶液样品，与1 μL 6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。加完样后，立即接通电源，使电压调到100 V，恒压电泳15 min。最后在凝胶成像仪下拍照。

3.4 PCR 反应

根据 FAD2A/FAD2B 等位基因的差异设计的AS-PCR 引物(Yu et al., 2013) (表 3)。为检测 FAD2A/FAD2B 的野生型和突变等位基 因分别设定四个PCR反应(Chen et al., 2010)，本研究分别检测 FAD2A 野生型等位基因(OL₁)、FAD2A 基因的突变等位基因(ol₁)、FAD2B 野生等位基因(OL₂)和FAD2B突变体等位基因(ol₂)。每个反应(总体 积为 25 mL)含有12.5 mL的 2× Taq PCR混合和3 个引物。这四个反应中所加引物如表4所示，利用FAD2A-F/FAD2-R和FAD2B-F/FAD2-R特异性PCR引物分别扩增 1.2 kb的 FAD2A和FAD2B 基因片段作 为参照带来验证 PCR。PCR 程序：94℃温度下 2 min， 其次是 94℃温度下每 30 s 30 个周期，53℃温度下30 s和72℃温度下90 s，和最后72℃下延伸5 min。

表 3 FAD2A/FAD2B 等位基因的AS-PCR引物序列

表 4 鉴定FAD2A/FAD2B 基因型时4个PCR 反应中引物的组合

3.5品质测定与统计方法

12个花生品系于2013年种植在河南农业大学科教园区。晒干后分别取饱满的成熟一致的单粒种子用德国布鲁克公司生产的近红外仪进行扫描，收集光谱数据，利用王传堂构建的近红外模型进行脂肪及主要脂肪酸含量分析(张建成等, 2011)。应用DPS统计软件(唐启义和冯明光, 2002)进行相关性分析。

作者贡献

王允和张幸果是本研究的实验设计和实验研究 的执行人；李贺敏和甄愿愿完成数据分析，论文初稿的写作；崔党群参与实验设计，试验结果分析；殷冬梅是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目(31471525)和河南省现代农业产业技术体系(S2014-05-G03)共同资助。

参考文献

Bolton G.E., and Sanders T.H., 2002, Effect of roasting oil com- position on the stability of roasted high-oleic peanuts, Jour- nal of the American Oil Chemists' Society.,79(2): 129-132

Chen Z.B., Wang M.L., Barkley N.A., and Pittman R.N., 2010, A simple allele-specific PCR assay for detecting FAD2 alleles in both A and B genomes of the cultivated peanut for high-oleate trait selection, Plant Mol. Biol. Rep., 28(3): 542-548

Chu Y., Ramos L., Holbrook C.C., and Ozias-Akins P., 2007, Fre- quency of a loss-of-function mutation in oleoyl-PC desaturase (ahFAD2A) in the mini-core of the U.S. peanut germplasm collection, Crop Sci., 47(6): 2372-2378

Ding J.P., Han Z.Q., Zhou R.Y., Gao G.Q., and Yang Y.P., 2007, Genetic analysis of oleic/linolei (O/L) ratio in peanut, Zhong guo Youliao Zuowu Xuebao (Chinese Journal of Oil Crop Sciences), 29(3): 233-237 (丁锦平, 韩柱强, 周瑞阳, 高国庆, 杨玉萍, 2007, 花生油酸亚油酸比值(O/L)的遗传分析, 中国 油料作物学报, 29(3): 233-237)

Jung S., Powell G.L., Moore K., and Abbott A.G., 2000a, The high oleate trait in the cultivated peanut (Arachis hypogaea): II. Molecular basis and genetics of the trait, Mol. Gen. Genet., 263(5): 806-811

Jung S., Swift D., Sengoku E., Patel M., Teule F., Powell G., Moore K., and Abbott A., 2000b, The high oleate trait in the cultivated peanut (Arachis hypogaea L.), I. isolation and char- acterization of two genes encoding microsomal oleoyl-PC desaturases, Mol. Gen. Genet., 263(5): 796-805

Jung S., Tate P.L., Horn R., Kochert G., Moore K., and Abbott A.G., 2003, The phylogenetic relationship of possible pro- genitors of the cultivated peanut, J. Her., 94(4): 334-340

Lei Y., Jiang H.F., Wen Q.G., Huang  J.Q., Yan  L.Y., and  Liao B.S., 2010, Frequencies of ahFAD2A alleles in Chi- nese peanut mini core collection and     its correlation  with oleic acid content, Zuowu Xuebao (Acta Agronomica Sini- ca), 36(11): 1864-1869 (雷永, 姜慧芳, 文奇根, 黄家权, 晏立英, 廖伯寿, 2010, ahFAD2A 等位基因在中国花生 小核心种质中的分布及其与种子油酸含量的相关性分 析, 作物学报, 36(11): 1864-1869)

Lopez Y., Nadaf H.L., Smith O.D., Connell J.P., Reddy A.S., and Fritz A.K., 2000, Isolation and characterization of the Δ12-fatty acid desaturase in peanut (Arachis hypogaea L.) and search for polymorphisms for the high oleate trait in Spanish market-type lines, Theor. Appl. Genet., 101(7): 1131-1138

Lopez Y., Nadaf H.L., Smith O.D., Simpson C.E., and Fritz A.K., 2002, Expressed variants of Δ12-fatty acid desaturase for the high oleate trait in Spanish market-type peanut lines, Mol. Breed., 9(3): 183-190

Lopez Y., Samith O.D., Senseman S.A., and Rooney W.L., 2001, Genetic factors influencing high oleic acid content in Span- ish market-type peanut cultivars, Crop Sci., 41(1): 51-56

Patel M., Jung S., Morre K., and Powell G., 2004, High-oleate peanut mutants result from a MITE insertion into the FAD2 gene, Theor. Appl. Genet., 108(8): 1492-1502

Tang Q.Y., and Feng M.G., eds., 2002, DPS Date processing system for practical statistics, Science Press, Beijing, China, pp. 1-648 (唐启义, 冯明光, 编著, 2002, 实用统计分析及其 DPS 数据处理系统, 科学出版社, 中国, 北京, pp.1-648)

Yin D.M., Cui D.Q., and Jia B., 2007, The construction of a high-efficiency expression vector of Δ12 fatty acid desaturase from Arachis and prokaryotical expression, J. Genet. Ge- nomics, 34(1): 81-88

Yu H.T., Yang W.Q., Tang Y.Y., Wang X.Z., and Wu Q., 2013, An AS-PCR assay for accurate genotyping of FAD2A/FAD2B gene in peanut (Arachis hypogaea L.), Grasasy Aceites, 64(4): 395-399

Yu S.L., Pan L.J., Yang Q.L., Min P., Ren Z.K., and Zhang H.S., 2008, Comparison of the Δ12 fatty acid desaturase gene be- tween high-oleic and normal-oleic peanut genotypes, J. Genet. Genomics, 35: 679-685

Zhang J.C., Wang C.T., Wang X.Z., Tang Y.Y., Zhang S.W., and Li G.J., 2011, NIRS calibration models predictive of oleic, linoleic and palmitic acid content in sun-dried bulk peanut seed samples, Zhongguo Nongxue Tongbao (Chinese Agri- cultural Science Bulletin), 27(3): 90-93 (张建成, 王传堂, 王 秀贞, 唐月异, 张树伟, 李贵杰, 2011, 花生自然风干种子 油酸、亚油酸和棕榈酸含量的近红外分析模型构建, 中国 农学通报, 27(3): 90-93)

Zhou L.X., Tang G.Y., Chen G., Bi Y.P., and Shan L., 2011, Correlation   between   AhFAD2   polymorphism   and oleic acid/linoleic acid ratio in peanut seeds, Zuowu Xuebao (Acta Agronomica Sinica), 37(3): 415-423 (周丽侠, 唐桂英, 陈高, 毕玉平, 单雷, 2011, 花生 AhFAD2 基因的多态性及其与 籽粒油酸 / 亚油酸比值间的相关性, 作物学报, 37(3): 415-423)