植物油脂的主要成分甘油三脂肪酸酯，又称三酰甘油(triacylglycerol, TAG)，是在内质网中3 种酰基转移酶的作用下，游离脂肪酸逐步加在甘油-3-磷酸的骨架上而形成的(Cao et al., 2006; Baral et al.,2012)。该过程中的3 种酰基转移酶分别为甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)和二酰甘油酰基转移酶(DGAT)。其中，LPAAT催化脂肪酸酰基从脂酰-CoA 加到溶血磷脂酸的sn-2 位，产物磷脂酸(PA)可用于继续合成TAG，也可用于合成其它磷脂类物质(Weselake et al., 2009)。

目前对LPAAT 编码基因的报道多见于拟南芥(Arabidopsis thaliana)和油菜(Brassica napus)，AtLPAAT1是拟南芥中唯一编码质体型LPAAT 的基因，由7 个外显子组成，编码356 个氨基酸(Kim and Huang,2004)。而在油菜中，BnLPAAT1 编码344 个氨基酸且存在多个拷贝，但AtLPAAT1 和BnLPAAT1 蛋白转运肽的位置、跨膜结构域数以及2 个保守基序(NHX4D 和EGT)均分别相同；拟南芥AtLPAAT2 和AtLPAAT3 蛋白分别编码377 和390 个氨基酸，它们4 个跨膜结构域和2 个保守基序的位置分别相似；与AtLPAAT2 相比，油菜BnLPAAT2 的3 个跨膜区域以及2 个保守基序的位置与前者相似，但较其缺少一个跨膜结构域，BnLPAAT3 蛋白尚未见报道；AtLPAAT4 和AtLPAAT5 分别编码376 和379 个氨基酸，二者3 个跨膜结构域和2 个保守基序的位置也分别相似(Kim and Huang, 2004)。这些研究结果表明LPAAT 具有类型多样性的特点，也为花生LPAAT 基因的研究提供了参考。

大量研究表明LPAAT 具有很强的底物选择性，即TAG sn-2 位的酰基类型受到该酶底物选择性的高度限制(Bemerth and Frentzen, 1990; Zhu et al., 2009;Arroyo-Caro, 2013)。Zou 等(1997)研究认为酵母的SLC1 基因编码具LPAAT 活性的蛋白质，其突变基因slc1-1 的编码产物对长链脂肪酸有更大的偏好性，将突变基因转入油菜和拟南芥后发现TAG 的sn-2 位置上超长链脂肪酸增加而且种子中总脂肪酸的含量升高了8%~48%，这一结果为利用基因工程创造特高脂肪酸含量的新型油料植物提供了依据。Kim和Huang (2004)研究表明，AtLPAAT1 对16:0-CoA比18:1-CoA 有更大偏好性，具有典型的原核途径脂类合成特征。Bourgis 等(1999)认为胞质LPAAT对亚麻酸的偏好性大于油酸，不接受C16 和C18 的饱和酰基群。Maisonneuve 等(2010)研究认为拟南芥基因组中的LPAAT 至少有9 个(Roscoe, 2005; 陈四龙等, 2012)，可分为3 类：AtLPAAT2、AtLPAAT3、AtLPAAT6 和AtLPAAT7 为第一类，主要参与真核途径甘油脂类的合成；AtLPAAT1、AtLPAAT5 和AtLPAAT8 为第二类，参与原核途径质体中脂类的合成；AtLPAAT4、AtLPAAT9 和AtLPAAT10 为第三类，功能尚未知。这些基因分布于拟南芥基因组的5 条染色体上，并不成簇存在(Maisonneuve et al., 2003)。

在花生中，陈四龙等(2012)已获得LPAAT 基因家族的2 个成员———LPAAT 和 LPAAT4 (Chen et al.,2012)。LPAAT 为内质网型蛋白，其表达无组织特异性，基因表达量与花生种子含油量积累速率变化趋势一致(陈四龙等, 2012)；LPAAT4 为胞质结合蛋白，在除花之外的多个组织中均有表达(Chen et al.,2012)。中山大学刘琛(2010)通过设计简并引物克隆到花生中编码LPAAT 的基因，RT-PCR 和qRT-PCR结果表明该基因在花生各组织中均有表达；洋葱瞬时表达体系表明该LPAAT 蛋白定位于质膜上；温度敏感LPAAT 缺陷型大肠杆菌JC201 温度互补实验证明该基因不是质体型LPAAT。在此基础上，本研究参考他的引物序列，从花生栽培品种(Arachis hypogaeaL., 染色体组为AABB)和二倍体野生种(wilddiploid species, 染色体组为AA 或BB) 中克隆得到LPAAT，对栽培种与野生种间LPAAT 的基因序列多态性进行了分析，并探讨了花生栽培种染色体组的起源进化关系。

1结果与分析

1.1 LPAAT 的克隆

以花生栽培品种花育32 号的种子cDNA 为模板进行PCR 扩增，获得约1.2 Kb 的电泳条带，与预期大小相符，将目的条带回收、测序。测序结果为两条序列，分别命名为rlpaat-1 和rlpaat-2，所推导的氨基酸序列命名为LPAAT-1 和LPAAT-2。软件分析显示rlpaat-1 和rlpaat-2 开放阅读框长度均为1 131 bp，编码376 个氨基酸，这两条序列间存在11个SNP (单核苷酸多态性)位点的差异。将这两条序列与刘琛在栽培品种汕油523 中获得的cDNA 序列(命名为syrlpaat) (刘琛, 2010)进行比对，发现rlpaat-1 与之存在4 个SNP 位点的差异，rlpaat-2 与之存在15 个SNP 位点的差异(表1)，即rlpaat-1 与syrlpaat的同源性更高。

以花育32 号和4 个野生种的叶片DNA 为模板进行PCR 扩增，各获得约3.5 kb 的电泳条带，将产物回收、测序。结果显示从花育32 号中得到两条序列，长度分别为3 729 bp 和3 736 bp，分别命名为glpaat-1 和glpaat-2；4 个野生种各获得1 条序列，A.correntina、A. duranensis、A. batizocoi 和A. ipaensisLPAAT 的基因序列长度依次为3 757 bp、3 757 bp,3 742 bp 和3756 bp，分别命名为Acorlpaat、Adurlpaat、Abatlpaat 和Aipalpaat。基因结构分析表明glpaat-1和glpaat-2 均由12 个外显子和11 个内含子组成(图1)，二者共存在37 处碱基差异，其中34 处为SNP位点(图2 显示了部分SNP 差异位点) (表2)，二者核苷酸序列一致性为98.80%。A 组2 个野生种A. correntina和A. duranensis LPAAT 的序列一致性为99.87% ，B 组2 个品种A. batizocoi 和A. ipaensis LPAAT 的序列一致性为95.91%。glpaat-2 与Acorlpaat、Adurlpaat、Abatlpaat 和Aipalpaat 的一致性分别为97.06%、96.98%、96.69%和95.50%，即glpaat-2 与A 组2 个野生种LPAAT 基因序列的同源性高于B组的；glpaat-1 与4 个野生种LPAAT 序列的一致性分别为96.61%、96.53%、96.24%和96.36%，在不同染色体组间无明显差别。

1.2 LPAAT 蛋白的生物信息学分析

蛋白质二级结构预测表明，LPAAT-1 和LPAAT-2 均含有47.34%的α- 螺旋、15.69%的延伸链、2.66%的β 转角和34.31%的不规则卷曲。LPAAT-1的理论分子量MW (molecular weight)为43.36 kD，等电点pI (isoelectric point)为9.13，平均亲水系数GRAVY (grand average of hydropathicity) 为-0.170；LPAAT-2 的MW 为43.39 kD、pI 为9.13，GRAVY为-0.173。将LPAAT 蛋白载入NCBI CDD 数据库，显示氨基酸序列V152-K274 为典型的酰基转移酶功能结构域，在该区域内还含有4 个高度保守的氨基酸基序，其中基序Ⅰ(VANHTSMIDF)即NH(X4)D基序中的天冬氨酸和组氨酸、基序Ⅲ(IFPEGT)中的甘氨酸以及基序Ⅳ(VCPVAI)中的脯氨酸是重要的酰基转移酶催化活性中心；基序Ⅱ(IWFNR)中的苯丙氨酸和精氨酸及基序Ⅲ中的谷氨酸是甘油-3- 磷酸底物结合的重要位点(Lewin et al., 1999; Gidda et al., 2009)。跨膜结构预测表明该蛋白序列P74-L96、F100-L122 和S135-V152 为3 个跨膜区域。亚细胞定位预测表明LPAAT 蛋白定位于质膜的可信度为6.0，内质网为5.0，细胞质为2.0。

氨基酸序列比对分析表明，LPAAT-1 与LPAAT-2 有1 个氨基酸残基的差异，同源性高达99.73%，与所参考序列有2 个氨基酸残基的差异，同源性达99.47%；与蓖麻(Ricinus communis) (Genbank 登录号:ACB30546)和拟南芥(Genbank 登录号: AAP04020) 氨基酸序列同源性分别为86.97%和84.88%。

1.3栽培种与野生种LPAAT 核苷酸序列的系统进化分析

进化树表明，4 个野生种中A 组的两个野生种A. correntina 和A. duranensis 关系最近，而B 组的A. ipaensis 与来自A 组的2 个品种以及同来自B 组的A. batizocoi 相距较远；A. ipaensis 与栽培种的亲缘关系最近，A. correntina 和A. duranensis 与栽培种的亲缘关系相似(图2)。

2讨论

从花生栽培品种中克隆得到LPAAT 的2 条cDNA序列和2 条DNA 序列，本研究所得的rlpaat-1 序列与刘琛(2010)在汕油523 中得到的cDNA 序列同源性较高，而另一序列rlpaat-2 与之同源性稍低，推测rlpaat-1 和rlpaat-2 来自不同染色体组，同时也验证了花生栽培种的遗传基础狭窄，多态性水平低这一说法(Milla et al., 2005)。两DNA 序列中所有内含子的剪切方式均符合经典的GT-AG 规则；两条序列之间的差异位点多位于内含子部分且由碱基的重复或缺失所导致突变的比例较大，说明内含子部分发生碱基突变的频率远高于外显子部分。

一般认为花生栽培种是由2 个具有不同染色体组的二倍体野生种通过自然杂交然后一次性加倍进化而来的，不同的花生栽培品种很可能具有相同的二倍体野生种祖先，很多研究者认为A. duranensis和A. ipaensis 最可能是栽培种的祖先(Jung et al.,2003; Moretzsohn et al., 2004; Seijo et al., 2007)。本课题组通过研究2- 甲基-6- 植基-1,4- 苯醌甲基转移酶基因VTE3 (郭安强等, 2012)和Δ⁹- 硬脂酰-ACP脱氢酶基因SAD 的起源进化，也得出了相同的结论(东金玉等, 2012)。在本研究中，核苷酸序列比对和系统进化树分析结果表明，花生栽培种LPAAT 的两条序列glpaat-2 与glpaat-1 分别来自A、B 染色体组(Smartt et al., 1978)，B 组野生种A. ipaensis 与栽培花生的亲缘关系最近，而A 组的A. correntina 和A.duranensis 与栽培花生的亲缘关系相近。

LPAAT 是酰基转移酶家族的成员之一，该酶呈现出底物特异性与类型多样性的双重特点(Brown etal., 2002)，本研究所得的LPAAT 蛋白与拟南芥LPAAT2-5 蛋白的氨基酸序列同源性仅10.63%~14.58%，与花生中2 个已发表基因的氨基酸序列同源性也只有11%左右，说明LPAAT 在进化过程中的多样性特点。

3材料与方法

3.1试验材料

3.1.1植物材料

花生栽培品种花育32 号由山东省花生研究所选育，4 个花生区组二倍体野生种材料A. correntina、A. duranensis、A. batizocoi 和A. ipaensis 由中国农业科学院油料作物研究所姜慧芳研究员提供。

3.1.2试剂

TIANgel 胶回收试剂盒、RNAprep Pure 植物总RNA 提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，pEASY-T1 Cloning Kit 及大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1 购自北京全式金生物技术有限公司；其他试剂均为进口或国产分析纯；引物由上海生工生物工程有限公司合成；测序工作由北京六合华大基因科技有限公司完成。

3.2试验方法

3.2.1叶片基因组DNA 和种子总RNA 提取及cDNA合成

采用CTAB 法提取花生幼嫩叶片的基因组DNA；按照植物总RNA 提取试剂盒的说明书提取花生种子总RNA；根据cDNA 反转录试剂盒的说明合成cDNA。

3.2.2 LPAAT 全长cDNA 序列和DNA 序列的克隆

参考中山大学刘琛(2010)的引物序列F：5'-ATGACTACCACTGGGACACTCAAG-3'；R：5'-TCATTTTTCCTCCAAACGCCGTAGC-3'。以花育32 号的种子cDNA 为模板，PCR 扩增条件为：95℃预变性5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min 10 s，35 个循环；72℃后延伸10 min。以花育32 号和4 个野生种的叶片DNA 为模板，PCR 扩增条件为：95℃预变性5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 4 min，35 个循环；72℃后延伸10 min。

3.2.3 PCR 产物的回收、测序

PCR 产物的胶回收、连接和测序等方法参照文献(东金玉等, 2012)。由于花生栽培种属异源四倍体，测序结果可能是2 条序列，因此花育32 号至少送6个单克隆用于测序，以保证每条序列3 个重复；每个野生种品种至少送3个单克隆。

3.2.4 序列生物信息学分析

利用NCBI 和DNAMAN 软件分析核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同源性；采用MEGA5.0 软件的Neighbor-Joining 算法构建系统进化树，Bootstrap检验，并重复1 000 次。基因结构作图：GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php/)；蛋白质二级结构分析软件：SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html/)；蛋白跨膜结构预测：TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；氨基酸基本理化性质：ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html/)；蛋白质保守结构域：NCBI CDD 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/)；蛋白质的亚细胞定位：WoLF PSORT (http://psort.hgc.jp/form.html/)。

作者贡献

华方静是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；张昆完成试验材料的种植；刘风珍和万勇善是项目的构思者及负责人，指导试验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由山东省花生良种产业化工程项目、山东省现代农业产业技术体系花生创新团队建设项目、国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目(CARS-14)、十二五农村领域国家科技计划项目(20-11BAD35B04)和国家自然科学基金项目(31271757)共同资助。

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