叶酸(Folate)是一类生化特征相近，化学结构相 似的化合物统称，是一种水溶性 B 族维生素，又称维 生素 M、维生素 Bc 或蝶酰谷氨酸，由蝶啶、对氨基苯甲酸和 1 个或多个谷氨酸结合而成(图 1) (Hao et al., 1999; 李莎等, 2012)。

叶酸是维持生物体正常生命过程所必需的一类 有机物质，是大多数生物体内一碳单元的供体，是参 与核酸、氨基酸等生物代谢所必需的元素(汪锦邦等, 2000)。人类和其他动物不能自身合成叶酸(Cossins and Chen, 1997; Rébeillé and Douce, 1999) ，需要通过植物这种饮食来源来摄取 (de Bree et al., 1997)。成年人 每天应摄取至少 200 μg 叶酸，孕妇和乳母为 400 μg 叶酸(Scott et al., 2000)。人体缺乏叶酸时，会导致贫 血、神经系统疾病，心血管病以及癌症等发病率也会 显著增加(Hossain et al., 2004)。叶酸量摄取不足是一 个全球化的健康问题(Bekaert et al., 2007)。发达国家 通过在食品中添加人工合成的叶酸来改善人们的叶 酸供给水平，但过量地摄入叶酸也会引起一些不良的 反应，并间接地促进肿瘤的生长(Scott et al., 2000)。通 过食用蔬菜，豆类等，补充叶酸是十分安全有效的方 式。近几十年，随着生物技术的日益发展，广大科研 工作者成功将参与叶酸代谢合成的一些基因通过生 物技术手段对主要农作物进行叶酸强化育种工作， 在当代育种工作中受到广泛关注。

Dihydroneopterin (DHN) 醛缩酶是参与调控叶 酸合成的一种酶，这种酶催化 7,8-dihydroneopterin (DHN)，转换为 6- 羟甲基 -7,8- 二氢喋呤酸化酶，由 folB 基因在大肠杆菌中编码。folB 已经在多种细菌和 卡氏肺囊虫中克隆鉴定，在肺炎链球菌中 folB 是调 控蛋白，具有 DHNA 和二羟甲基二氢喋呤焦磷酸酶 的作用。而在卡氏肺囊虫中的 folB 为三功能蛋白酶， 除具备 DHNA 和二羟甲基二氢喋呤焦磷酸酶功能 外，还具有二氢喋酸合酶的活性(Goyer et al., 2004; Di- ttrich et al., 2008)。Goyer 等(2004)首先对植物中的 folB 蛋白进行了报道。拟南芥中克隆得到 3 个与 folB 同源 的基因序列，编号为 AtfolB1-3。番茄中也得到一种与 folB 类似的蛋白 LefolB。Goyer 等(2004)在大肠杆菌中 过表达了 AtfolB1-3 和 LefolB1，除 AtfolB3 没有以活 性形式表达外，其他 3 种蛋白都具有 DHNA 活性。

豆类作物，本身叶酸含量较高，但受到储存方式，食品加工方式等客观因素影响，最终提供给人体利用的叶酸却很少。本研究采用拟南芥来源的叶酸 合成途径调控基因 folB，构建在植物表达载体中，并通过转基因技术将叶酸调控基因 folB 整合到大豆基 因组中，旨在生产出高叶酸含量的大豆品种，以满足 人们对叶酸日益增长的需求。

1结果与分析

1.1目的基因的克隆

以人工合成的 folB 基因为模板，以 folB-FR 为引 物，在左右引物中分别引入 BamHⅠ和 SacⅠ酶切位点，通过 PCR 扩增得到 folB 基因全长 441 bp，然后 克隆到 pTF101-35S 载体中(图2A)，构建好的质粒经 过测序和酶切检测(图2B)正确后转入农杆菌 EHA101 中，用于大豆遗传转化。

1.2大豆子叶节的遗传转化

将带有基因 folB 的表达载体，通过液氮冻融法 转化在农杆菌菌株 EHA101 中，通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法，对大豆受体品种 Williams82 进行转化(图 3)。共切取 200 个大豆外植体，经过继代筛选，生根成苗，最终得到T0代转基因再生植株26株，转化率接近 13%。

1.3转基因阳性植株筛选鉴定

转化苗通过草丁膦涂抹鉴定得到 15 株表现除草 剂抗性的转化苗(图 4)，通过 PCR 检测目的基因 folB， 检测出12株呈阳性的T0代转基因植株(图 5)。通过 Southern 杂交方法对得到的 12 株 PCR 呈阳性的转 基因植株进行了拷贝数的分析。经过 bar 试纸条检测得到 10株(图 6)试纸条阳性转化苗。Southern 杂交结果表明，在 10个转基因植珠中得到 9个株系为 folB全长 cDNA插入到基因组中(图 7)。经过内切酶 EcoR Ⅰ酶切，转基因植株 4~12 有杂交带出现，3号13 号 没有杂交带出现，而3号为非转基因植株对照。这说明目的基因已经整合到植物基因组中。13 号转基因植株在图 4 中没有条带，说明是假阳性，目的基因并没有真正地整合到植物基因组中。杂交带大小有所 不同，说明外源基因整合位点不同。

2讨论

随着转基因技术的发展，转基因辅助育种成为现代育种工程重要手段之一。大豆子叶节遗传转化法是 比较快捷的，从切子叶节到得到阳性苗，仅需4个月左右的时间就能完成。但转化苗存在一定数量的嵌合体和高拷贝数，这一点对日后的育种工作不利。转化苗的阳性率和外源基因的整合性与转化过程中所 用的表达载体，受体基因型，农杆菌毒性等因素有 关。Olhoft 等(2004)研究表明培养基中适当添加银离 子可以增加外源基因的插入效率和获得更多的单拷 贝植株。本研究的生苗率接近 13%，阳性率为 4.5%， 阳性率较低，因此如何提高大豆转基因阳性率和单 拷贝数量，是有待解决的问题。

提高植物体内叶酸的含量主要有三种方式：第一种是通过合成途径的限速酶来改造合成途径；第二种是减少叶酸的分解；第三种是提高叶酸的稳定性。三种方式可以共同协作，也可单独加强。当叶酸与其依赖蛋白结合时，稳定性大大提高。因此过量表达叶酸依赖蛋白或调控蛋白，有可能提高叶酸的含量。在本研究中我们已将高叶酸 folB调控基因成功 导入到大豆受体材料中,并且获得了southern杂交阳性的转基因株系，但对叶酸含量还未进行测定。在后期工作中将对初世代材料加代繁殖，测定材料中的不同组织内的叶酸含量。

3材料与方法

3.1材料

3.1.1受体材料

受体材料为大豆品种 Williams82，由农业生物技术研究所转基因大豆课题组提供。

3.1.2菌种和质粒

大肠杆菌菌株为 E. coli Trans10，农杆菌菌株为 EHA101，植物表达载体 pTF101-35S，高叶酸调控基 因 folB 均由农业生物技术研究所大豆课题提供。

3.1.3生物试剂

聚合酶 2×Easy Tag PCR SuperMix购自北京全式金公司；限制性内切酶、T4-DNA连接酶等生物酶试剂购自NEB试剂公司；胶回收 DNA小片段试剂盒购自爱思进试剂生物公司；Southern 杂交试剂盒购自罗氏试剂公司，其他生化试剂均为国产分析纯产品。

3.2方法

3.2.1 植物表达载体的构建

根据NCBI上大肠杆菌folB基因(基因编号:BT030075)序列，按照密码子偏爱性，人工合成 folB基 因。在 folB基因上游引入内酶BamⅠ酶切位点，下游引入内切酶SacⅠ酶切位点。通过DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，把folB基因片段经 BamHⅠ和SacⅠ酶切后连接在pTF101-35S载体上形成 pTF101-35S-folB。同时针对folB基因，利用Primer Premier 5.0软件设计PCR分子检测扩增特异性引物如下：

folB-F：5'-TAGAAACAGAGGATCCATGCATAGCTCACTGGAGACCAC-3'，

folB-R：5'-GATCGGG GAAATTCGAGCTCTCAGTTCTTTGAACTAGTGTTTCGC-3'。

3.2.2农杆菌介导的大豆遗传转化

以农杆菌株 EHA101 作为工程菌株，将 pTF101- 35S-folB 通过大豆子叶节方法转入大豆受体材料 Willimas82 中。农杆菌介导大豆子叶节转化法基本 流程如下：(1)菌液制备：农杆菌 28℃培养 16 h 后收 集单克隆菌体，转入 YEP 液体培养基中，放入摇床 28℃，180 rpm 培养 12 h 左右至菌液 OD600 值 0.5~0.7 备用。(2)受体准备：选取大豆受体品种 Williams82 成 熟无破损的种子，氯气灭菌 16 h。灭菌后种子放入萌 发培养基(Olhoft et al., 2003)弱光萌发 16 h。(3)子叶节法：切子叶节，从胚轴处将大豆种子一分为二，切 时刀尖蘸工程菌液，用手术刀轻刮下胚轴，制造小创 口。将切开后的子叶节放入工程菌液中，轻柔晃动30 min 后转入共培养基中，避光培养(23℃, 3~5 d)。(4)共培养后，将伸长的胚轴切去约 3/4，保留约5 mm的胚轴，插入加筛选剂的分生培养基中，诱导丛生芽生 长，培养条件 25℃，光照 16 h·d-1，光照强度2 000 lx。 (5)在分生培养基中培养 7 d 后，转入筛选培养基中， 间隔15 d 继代1次，筛选 3~4 轮，得到伸长生长的分生苗。(6)将已经伸长的分生苗从外置体上切下，转入生根培养基中生根，生根10 d左右，得到转化苗。(7) 生根健全的转化苗，经炼苗(3~5 d)后移入盆中栽培， 温室正常管理。

3.2.3转基因植株的草丁膦抗性检测

植物表达载体以 bar (草丁膦)作为筛选标记，因此在转基因后代中可采用草丁膦涂抹叶片的方法快速检测转基因苗。具体方法：选取健康叶片，用棉签蘸取适量草丁膦(浓度为150 mg/L)溶液，轻柔涂抹转化苗半片叶子，并做好标记，同叶未涂抹的叶子作为对照，在 自然光照情况下 3~6 d后观察叶片生长和变色情况。

3.2.4转基因植株 T0 代的 PCR 检测

利用 folB 基因引物对 T0 代转基因植株基因组 DNA 进行 PCR 检测。使用 CTAB 法提取 T0 代转化植 株及对照 Willimas82 的 DNA。PCR 反应体系(25 μL)： DNA 模板 100 ng，2×Easy Tag PCR SuperMix 12.5 μL， 10 μmol/L 引物各 0.5 μL， 加 ddH2O 补至 25 μL。 PCR 反应程序：94℃，预变性 5 min，94℃，变性 30 s， 55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，30 个循环，72℃延伸5 min。PCR 扩增产物通过 1%琼脂糖凝胶电泳分离，并拍照和分析。

3.2.5 bar试纸条检测

取少量嫩绿叶子(约小指甲大小)放入 1.5 mL 的离心管中，加入 200 μL 提取缓冲液，用研磨棒捣碎混匀，将试纸条按箭头方向插入混合液中，静止 5 min 后观察结果。若试纸条出现 2 条带表明该植株是 bar 阳性植株，若出现 1 条带说明是 bar 阴性植株，如果 没有条带说明操作有误或提取缓冲液不对。

3.2.6 T0 代植株的 Southern 分析

为了检测 folB全长基因是否插入到大豆基因组 全长中及相对应的拷贝数，选取 bar试纸条检测呈阳 性的10个T0 代植株，进行基因组 DNA 的 Southern blot 分析。Southern blot 分析使用的是 Roche 地高辛 试剂盒 KitⅡ型，实验具体流程参照 Roche Southern blot KitⅡ型试剂盒说明书。以克隆到载体上的 folB 基因的全长作为 Southern 杂交探针，使用 EcoRⅠ内 切酶进行基因组DNA 酶切。

作者贡献

张原宇和张玲是本研究的实验设计和实验研究 的执行人，完成论文初稿的写作；王玉民和邢国杰参 与实验设计及论文修改；邢彬参与材料种植和数据 整理；李海云是项目的构思及负责人，指导实验设 计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并 同意最终的文本。

致谢

本研究由国家高技术研究发展计划“863 计划” (2012AA101106-3)、吉林省 2012 年度博士后科研项 目(20120010407)和转基因生物新品种培育重大专项 (2014ZX08004)共同资助。

参考文献

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