黑颈长尾雉(Syrmaticus humiae)属国家Ⅰ级保护雉类，已列入国际鸟类保护委员会世界濒危鸟类红皮书和我国国家重点保护野生动物名录。在我国仅分布于广西、云南的少数几个县境内(郑作新, 1978, 科学出版社, pp.172-177; 李汉华等, 1998)。目前生境严重破坏，野生数量已极端稀少，资源接近枯竭。因此，制定濒危动物野生和圈养种群的保护管理策略的一个主要目标，就是要维持该物种的遗传多样性(Frankham et al., 2002)。黑颈长尾雉的有效保护和人工繁殖对于扩大其种群，保护珍稀动物，维持生态平衡有着重要的意义。

目前对黑颈长尾雉的研究主要有黑颈长尾雉的分布(李汉华等, 1998; 韩联宪, 1997; 范喜顺等, 2004)，繁殖(陈伟才等, 2006; 刘小华等, 1991)，种群扩散(贝永建等, 2005)，人工饲养和繁殖(庾太林等, 1996)，笼养状态下求偶炫耀行为(李汉华等, 1999)，尚未发现对黑颈长尾雉的遗传多样性研究的报道。

运用RAPD (random amplified polymorphic DNA)技术(Welsh and Mclelland, 1990; Williams et al., 1990)，从分子水平上对圈养群体黑颈长尾雉的遗传多样性进行研究，以期了解其遗传多样性背景、群体内和群体间遗传分化水平，为其生物资源的种质保存、遗传改良及进一步的开发利用提供科学依据。

1结果与分析
1.1 RAPD扩增带谱分析
在50条随机引物中，筛选获得了14条引物能够产生重复的、清晰的扩增图谱，并以此进行分析(表1)。使用筛选得的14条随机引物对24只黑颈长尾雉进行PCR扩增，每条引物可产生6~12条特定的扩增谱带(图1)，从图看出，RAPD扩增产物清晰并且丰富，说明对黑颈长尾雉RAPD反应各参数的筛选是适合的、正确的。黑颈长尾雉的RAPD扩增谱带变异较大，14条引物的RAPD产物共检测到119个位点，其中98个为多态性位点，占82.35%，标记的分子量在0.2~3 kb之间。不同的引物所得到的扩增片段的数量各不相同。同时，不同的引物所揭示的多态性也不尽相同。

图1引物S1407扩增的24只黑颈长尾雉个体的RAPD产物电泳图 Figure 1 Electrophoretogram of typical RAPD band patterns produced by S1407 primers with 24 individuals of Syrmaticus humiae

表1 14条引物序列及RAPD扩增分析 Table 1 14 primers squences and the results of RAPD

1.2黑颈长尾雉的遗传多样性
用软件NTsys 2.10e进行分析，得到黑颈长尾雉24只个体的遗传距离P值矩阵(表2)。任意两个个体的P值在0.159 7~0.487 4范围之内。并依据24只黑颈长尾雉个体之间相互关系构建分支聚类图(图2)。黑颈长尾雉种群的平均遗传距离为0.281 0，即是说种群内个体的相似程度为0.719 0。

表2黑颈长尾雉的24个个体的RAPD－DNA片段的遗传相似系数与遗传距离 Table 2 The genetic identity and genetic distances of 24 individuals of Syrmaticus humiae based on RAPD data

图2黑颈长尾雉24个个体之间相互关系的分支聚类图 Figure 2 The dendrogram of the 24 individuals of Syrmaticus humiae

2讨论
由于RAPD技术具有良好的分辨率(Welsh and Mclelland, 1990; Williams et al., 1990)，遗传距离及聚类分析揭示了黑颈长尾雉的遗传变异水平。黑颈长尾雉种群的平均遗传距离为0.281 0，即是说种群内个体的相似程度为0.719 0。而多态位点的百分数为82.35%。相对其他物种来说，它的遗传变异水平是较高的，如南美白对虾(P. vannamei)的4个群体和家系,测得的多态位点百分数是58.75% (Garcia et al., 1994)。罗非鱼种群内个体间的相似率分别是尼罗罗非鱼为0.730，莫桑比克罗非鱼为0.78和奥利亚罗非鱼为0.87 (Dinesh et al., 1996)。6个鸡品种多态率84.30%，各品种内遗传相似度范围分别为0.798 1~0.868 5 (刘娣, 1999)，而滇金丝猴的个体间的遗传距离只有0.052，表明笼养滇金丝猴群体的遗传多样性很低(兰宏等, 1996)。因此，黑颈长尾雉的圈养种群具有较高水平的遗传多样性。

供试的24只黑颈长尾雉个体主要聚成三个群体，第二个群体里又分为几个小类群，并有分散的7号个体，总体比较分散。说明濒危雉类繁育基地内的黑颈长尾雉可能来自不同的地理种群，这与种源来源的实际相符合，该种群的亲代来自广西的隆林、西林和金钟山保护区。黑颈长尾雉的遗传变异水平较高，有助于黑颈长尾雉的生存与延续。通过对圈养黑颈长尾雉遗传多样性的分析，可以评价黑颈长尾雉种质资源的遗传学变化，为深入研究以及制定和采取相应的管理和保护措施提供基础数据。

3材料和方法
3.1材料
在广西自治区林业厅与广西师范大学生科院濒危雉类繁育基地随机从F₄~F₉子代的人工繁殖个体中抽取24只黑颈长尾雉(Syrmaticus humiae)用于实验分析。

3.2基因组DNA的提取
基因组DNA的提取参照高盐法(汪永庆等, 2001)，取黑颈长尾雉的新生羽毛2~3根(马逸清和李晓民, 2002; 丁长青, 2004)。放入1.5 mL离心管中，加入400 μL DNA提取缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0; 2 mmol/L EDTA, pH 8.0; 400 mmol/L NaCl; 1% SDS)。将样品剪碎混匀后，加入10 μL的蛋白酶K (20 g/L)混匀，55℃消化3~4 h (每20 min颠倒混匀)。加入10 μL RNase (10 g/L)，37℃水浴40~60 min。加入300 μL 6 mol/L NaCl，充分振荡混匀，12 000 r/min离心30 min，取上清液加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃沉淀1 h，12 000 r/min离心15 min，弃上清，加入600 μL 70%乙醇洗涤，12 000 r/min离心10 min，弃上清。加入600 μL无水乙醇，12 000 r/min离心10 min，弃上清，自然干燥后加入无菌超纯水30 μL溶解。1%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分光光度计测定浓度，稀释至一定浓度，-20℃保存备用。

3.3 RAPD-PCR扩增反应
用总体积为25 μL的PCR反应体系，其中灭菌双蒸馏纯净水12 μL；含2.5 μL 10×Buffer 2.5 μL；250 μmol/L dNTP 2.5 μL；1 mmol/L MgC12 2.5 μL；2.5U Taq酶2 μL；0.1 μmol/L引物1.5 μL；25 ng DNA 2 μL。
PCR反应条件是：预变性(94℃ 5 min)；变性(94℃ 1 min)；退火(40℃ 1 min)，延伸(72℃ 1.5 min)，共循环45次；最后进一步延伸(72℃ 10 min)。
在1%琼脂糖凝胶上对PCR扩增产物进行电泳并染色，用紫外凝胶成像系统进行观察并照相。

3.4分子数据记录与分析
根据PCR扩增产物的电泳结果，对在相同的迁移率上出现与未出现进行标记，出现的记为“1”，未出现的记为“0”，由此生成“0”和“1”的原始矩阵(Wang et al., 1997)。并对每个引物扩增的总带数和多态性带数进行统计。数据的聚类分析采用非加权算术平均对数法(UPMGA法)，建立个体间的亲缘关系树状图。用下列公式计算和分析黑颈长尾雉种群的遗传多样性数值。

个体间遗传相似性指数F：F=2Nxy/( Nx+Ny)，式中，Nx和Ny分别是个体x和y的扩增带数，Nxy是个体Nx和Ny的共有带数，遗传距离d=1-F (Lynch, 1990)。

多态位点比例P=多态位点数/位点总数。

作者贡献
庾太林完成实验设计、论文统稿修改并参与实验；韩增超参与实验全过程及论文初稿撰写；管清新、张良建及刘晓辉协助实验及材料的采集。

致谢
本项研究是在国家自然基金项目(No.31160426)的经费支助下，并在广西师范大学珍稀濒危动植物生态与环境保护省部共建教育部重点实验室完成实验工作。特此致谢。

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