天山雪莲，又名“雪荷花”，当地维吾尔语称其为“塔格依力斯”，是新疆特有的珍奇名贵中草药，主要 生长于海拔4 000 m左右气候奇寒、终年积雪不化的高原寒带地区。因天山雪莲独特的生存习性和生长环境，使其天然且稀有，并造就了它独特的药理作用和神奇的药用价值，被称为“百草之王”、“药中极品”。但由于野生的天山雪莲生长缓慢，加上长期以来人们无节制地采挖，导致这一自然资源匮乏。近年来，国内外众多学者对天山雪莲展开多方面的研究，使人们对它的有效成分、药用价值等有所了解，并开始对其进行人工繁殖，为更好地保护和开发这一天然资源奠定基础。本综述结合最近国内外学者对天山雪莲的研究成果，从生物技术方面对天山雪莲进 行总结，为更进一步开发这一资源提供文献依据。

1天山雪莲的生理和生态

天山雪莲生长在海拔约4 000 m终年积雪不化的碎石坡上。天山雪莲的茎和叶上密密麻麻地生长着白色棉毛，不仅可以防风保温，而且可以反射高山强 烈阳光辐射。因此，天山雪莲成为适应天气变化快、光线强、温度低、高山风大等特殊气候的典型植物。对天山中部3种自然环境下天山雪莲的光合生理生态特性进行调查研究(刘华等, 2009)。通过对不同海拔高度天山雪莲野生植株的光合生理参数与光照、温度等生态因子关系进行对比，发现天山雪莲对高山自然环境中变化的温度和光强有明显的生态适应性。研究发现天山雪莲开花过程中存在的雌雄异位、雄性先熟以及被动式花粉次级展现现象，这种现象减少了白花授粉的可能性。在自然条件下，其头状花序的结籽数和结籽率分别为(126.0依10.5)粒和(91.7依4.2)%，单株结籽数为(3 326.4依28.7)，这些数据表明雪莲在高山极端环境中能顺利地完成有性生殖过程(戴攀峰和谭敦炎, 2011)。这些表明，尽管天山雪莲的野生生境非常恶劣，但在长期的进化过程中它已从各方面适应了高原气候，同时也为天山雪莲在低海拔人工种植带来一定的难度。有研究者对天山雪莲的生物学特征、环境因素和标准化种植技术进行研究。这些研究使得新疆雪莲等药用植物的种植技术 和高山生态学保护(包括播种培养, 移植, 管理和预防 病虫害)等方面得以延伸(Nurbolat et al., 2012)。这也 更进一步说明天山雪莲人工种植的开展对保护野生 天山雪莲资源具有重要的作用。

2天山雪莲的组织培养

由于天山雪莲特殊的生长条件，使得雪莲人工繁殖具有很大的困难，而植物组织培养技术不受时间、地点、气候等环境条件的限制，以及培养条件可以受人为控制，易于实现规模化生产，为雪莲这一药用植物的大量繁殖提供一条重要的途径。

为此，人们开始利用组织培养技术对天山雪莲进行快速繁殖，研究表明影响天山雪莲组织培养的主要因素是：外植体、激素、培养基和培养条件。

2.1外植体对天山雪莲组织培养的影响

植物组织培养技术已被广泛运用于种苗生产，而外植体选择是天山雪莲组织培养、快繁技术成败与否的关键因素之一(周丽丽等, 2012)。外植体种类、生理状态及不同组织部位对天山雪莲初代组织培养及愈伤组织诱导有显著的影响，故而确定适宜的外 植体材料是进行天山雪莲组培快繁的关键。

在天山雪莲的组织培养中，人们已经使用过无菌幼苗的胚轴、胚芽、子叶、根、茎等诱导愈伤组织或不定芽的形成，也有通过体细胞胚胎来进行快速繁殖，不同的外植体诱导的效果和效率有很大的差异(表1)。

从表1可看出，在天山雪莲不定芽诱导时常用的外植体是根，茎，真叶，子叶，胚芽和胚轴，其中茎和胚芽作为外植体的诱导率最高为100%。在操作过程中，尽管真叶的诱导效率仅为66%左右，但是其生物量比较大，在取材方面也成为天山雪莲快速繁殖时外植体的重要来源。在诱导愈伤组织时，根和茎作为外植体时诱导频率也可达到100%。

表 1 外植体对天山雪莲组织培养的影响

2.2激素对天山雪莲组织培养的影响

植物激素对天山雪莲愈伤组织的诱导和分化有着显著影响。有些学者使用单激素诱导，其中NAA诱导效果较好(庞红霞等, 2010)。而更多的研究结果表明混合激素比单激素的诱导效果更好，最常用的就是NAA和6-BA组合，研究表明，以MS为基本培养基附加浓度1.00 mg/L的6-BA和2.00 mg/L的NAA组合为最佳愈伤组织诱导培养基，诱导率可达到100% (杨林和覃筱燕, 2006)。研究表明，细胞分裂素6-BA 对愈伤组织诱导率有较大的影响。当NAA浓度固定时，诱导频率随着6-BA浓度的降低而升高；当NAA与6-BA浓度比为1：0.5，6-BA浓度高于1.00 mg/L时，诱导率随6-BA浓度的升高而降低(覃建兵等, 2009)。除使用NAA和6-BA的组合外，在天山雪莲愈伤组织的诱导过程中还使用了2,4-D和NAA的组合，诱导效率达到100% (江丽丽等, 2011)。

TDZ是近几年发现用于组织培养的人工合成物质，是一种新型植物生长调节剂，具有强烈的细胞分裂素活性。在植物组织培养中，它对促进分生组织的形成和茎的增殖，其效应远比腺嘌呤型细胞分裂素(CTK)高很多倍(苑兆和等, 1995)。在天山雪莲培养中，通过以天山雪莲叶片为外植体诱导不定芽的形 成时发现，在培养基中单独添加0.5滋MTDZ，培养49天后，不定芽的诱导频率达到69%，每个外植体上不定芽的数量达8.5个，数量分别是BAP和NAA进行诱导时的1倍。但是，当TDZ作用时间大于45天后则不利于不定芽的继续生长(郭斌等, 2012)。

2.3培养条件对天山雪莲组织培养的影响

由于天山雪莲生长在高寒、高光强和低氧的特殊地区，所以人工培养时，光照、温度和大气压力等成为重要的影响因素。

2.3.1光照

光作为一种物理因子已广泛用于植物组织培养过程中的生长控制、光形态建成反应、形态发生及其各种反应机理的研究。光对于组织培养的影响主要表现在光强、光质、以及光照时间等方面(雷亮等, 2006)。

通过研究发现，长波长比白光更有利于诱导天山雪莲愈伤组织再分化，而光照的时间也对其愈伤组织的诱导起到显著影响。光照时间为16 h/d时愈伤组织的分化频率和平均出芽数达到最大，分别为76.7%和1.8个/块。但在持续光照条件下愈伤组织的分化能力反而下降，说明昼夜交替对愈伤组织分化必不可少的。试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，暗培养不适于天山雪莲的分化出芽(雷亮等, 2006)。还有研究表明长时间的，高强度的紫外光B的照射，并不会减少雪莲的光合作用。

2.3.2温度

影响植物发育、生长及光合作用的主要因素之一是温度，温度的变化影响酶的反应活性，低温不但会降低相关酶反应的活性，还会抑制酚类化合物的合成；而高温不仅会影响酶促反应的进行，也会导致培养基内非酶促反应的发生(朱文祥等, 2010)。研究发现，在天山雪莲愈伤组织超低温保存时，通过低温预处理，即对在液氮中存储的天山雪莲的愈伤组织的存活和再生频率进行了测试，发现当温度从20℃到40℃，存活率和再生率都达到最大值(56依3.61)%和(36依2.64)%，升高温度能够显著提高超低温保存后组织的存活率和再生频率(郭斌等, 2013)。研究发现， 昼夜温差与愈伤组织的再分化能力呈现出负相关关系，低温处理并不利于其愈伤组织的再分化。当昼夜温差为0℃时天山雪莲分化最好，说明在天山雪莲愈伤组织的脱分化-再分化过程中，对昼夜温差的适应性已丧失，长时间的低温处理不利于愈伤组织的分化(雷亮等, 2006)。

温度不仅影响天山雪莲离体组织形态发生，而且影响其种子的萌发。研究发现，在0/10℃变温条件下萌发率最高，达到46%；种子萌发的适宜温度范围介于10~25℃之间，这可能与天山雪莲适应高山上寒冷的气候条件有关(庞红霞, 2009)。

2.3.3大气压力

对于不同海拔和种类的植物，大气压力对其生长都具有很重要的作用，它影响着海拔梯度上植物种类的分布、植物群落的结构组成(潘红丽等, 2009)。且有研究表明大气压力显著影响小麦的生长和小麦籽粒蛋白质、糖的合成(唐永康等, 2008)。

天山雪莲生长在4 000 m左右的高海拔地区，在其生长过程中必然受到大气压力的影响。在天山雪莲人工培养时研究了不同大气压力对雪莲不定芽诱导的影响。结果表明：天山雪莲不定芽的诱导和生根均受到大气压力的影响。在60 kPa下，每个外植体上 的不定芽数量达到12个，分别是在101 kPa和30 kPa培养下的1.5和2.1倍。在30 kPa、60 kPa和101 kPa下，根的诱导频率分别为49%、72%和85.6% (Guo et al., 2011)。这说明，对天山雪莲人工培养时，参考源生 长地的生态环境设定培养条件是非常重要的。

大气压力对组织培养的影响机制还没有确切的理论，研究表明内源抗氧化酶的活性受到大气压力的显著影响。在逆境胁迫下(如大气压力的改变)，由于环境因素的剧烈改变，对植物间接造成氧化胁迫，导致植物体内活性氧数量暴增，植物的抗氧化酶活性迅速升高(李璇等, 2013)。有研究发现了大气压力的变化显著影响着天山雪莲组织中抗氧化酶的活性，并与离体培养下天山雪莲不定芽的诱导频率和数量相关(Guo et al., 2011)。

3天山雪莲的分子生物学研究

分子生物学在药用植物研究中发挥着很大的作用，药用植物的基因与转基因工程不但可以改变传统遗传性状，培育优良品种，提高有效药物成分含量和植物抗病虫害能力，还可以保护和繁殖濒临灭绝的植物(卢宝伟等, 2005)。

近几年在天山雪莲的研究中有关分子生物学方 面的研究也越来越多，主要集中在利用分子生物学技术构建天山雪莲全长cDNA文库；利用生物信息学从天山雪莲中分析与抗寒，抗旱等有关的基因，并在大肠杆菌或其他植物(烟草)中表达。针对天山雪莲次生代谢产物(类黄酮)的生物合成进行相关的遗传转化以提高其产量。

3.1遗传转化体系的建立和稳定性分析

在含有不同浓度的BCDB培养基上培养天山雪莲愈伤组织或再生苗，观察并比较经不同处理后天山雪莲的存活状况，确定了抑制非转化细胞生长的 适宜浓度(武运芳等, 2012)。这项研究为转化体的筛选提供试验方法。在遗传转化体系的建立和稳定性分析的研究方面，采用根癌农杆菌介导法进行 GFP 基因的遗传转化，由此建立了农杆菌介导天山雪莲 遗传转化体系(管岩岩等, 2010)。这些研究为天山雪莲分子生物学反面的研究奠定了基础。

3.2构建文库

利用天山雪莲的幼嫩叶片为研究材料，构建了天山雪莲叶片全长cDNA文库通过CreatorTM SMARTTMcDNALibraryConstruction技术(祝建波等, 2006)。天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建则为雪莲基因资源保存和植物抗寒机理的研究奠定了基础。以野生天山雪莲为研究材料，通过CreatorSMARTTMcDNA Library Construction 技术构建了雪莲全长cDNA文库，并从中随机选取500个进行序列测定，将所测序列通过GenBank检索和生物信息学进行分析，发现共有56个序列为非冗余数据，其中的14个cDNA片段序列在GenBank上无明显的同源性，其余42个片段与已知基因有较高的同源性(王博等, 2008)。该研究不但为进一步克隆和筛选天山雪莲特异性表达 基因提供材料，而且补充了天山雪莲基因组数据。以天山雪莲为材料，从经低温处理后的天山雪莲叶片中提取并分离mRNA，合成双链cDNA。利用gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库，为进一步高通量筛选天山雪莲抗寒基因奠定了基础(李晨等, 2010)。

3.3胁迫相关的基因克隆

由于天山雪莲处于海拔 4 000 m 左右的高寒地区，因此可能具有潜在的抗冻、抗旱基因；终年积雪不化的高原土壤，使其可能具有耐盐性以及特殊的与调控水分的蛋白(水孔蛋白)相关的基因；4 000 m左右的高海拔，强烈的紫外光照射，高光强，使其可能具有某些与光合作用因子相关的基因等。

已对天山雪莲中的抗冻基因、耐盐基因、抗旱基 因、水孔蛋白基因以及和光合作用相关的基因进行了克隆(表2)。

3.4次生代谢产物

天山雪莲活性次生代谢产物主要是黄酮、生物碱和多糖类(贾景明和吴春福, 2007)。目前已经开始通过培养天山雪莲的愈伤组织生产雪莲黄酮，但其含量非常低，根不能满足规模化生产的需求。通过分子手段对次生代谢产物的调控是一条重要的手段，次生代谢产物合成途径的基础研究将越来越受到重视，其中黄酮类生物合成分子生物学的研究最为深入(陈晓亚和刘培, 1996)。二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是植物产生花青素合成途径中的关键酶(覃建兵等, 2012)。采用RT-PCR和RACE技术从天山雪莲中克隆得到DFR基因，将该基因通过农杆菌介导的叶片转化法进行同源转化，并将含有转DFR基因的愈伤组织进行悬浮培养，通过紫外分光光度法测定其愈伤组织的总黄酮含量，发现转基因的愈伤组织总黄酮含量是非转基因愈伤组织中总黄酮的含量的1.86倍。这项研究为提高天山雪莲有效药用成分 黄酮类物质及实现天山雪莲花青素的人工生物合成奠定了基础。

表 2 天山雪莲中与胁迫相关的基因的克隆及功能研究

另外，利用同源克隆的方法克隆了天山雪莲花 青素生物合成关键酶基因，并利用农杆菌介导的同源转化法，将天山雪莲二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)和UDP葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶(3GT)基因转化到天山雪莲的愈伤组织内，使得DFR 和3GT基因共同在天山雪莲细胞内进行表达，进而发现，该技术能够使天山雪莲的次生代谢产物黄酮类物质的产量加倍，共转后的愈伤组织的总黄酮含 量是非转基因的3.61倍(唐亚萍等, 2012)。利用RTPCR方法对Sik P和Sik TTG1基因克隆并对它们生物信息学进行分析，构建表达载体，并利用农杆菌介 导法转化天山雪莲和番茄，鉴定转基因植株，对转基 因天山雪莲叶片和番茄叶片的类黄酮含量进行测 定，结果发现转Sik P基因的天山雪莲和番茄叶片的 类黄酮含量明显增加，转SmTTG1基因的番茄叶片 类黄酮含量也明显增加(张丽等, 2015)。这项研究说明天山雪莲Myb转录因子Sik P基因和WD40转录因子SmTTG1基因对植物次生代谢具有重要的调控作用，能够有效地提高类黄酮的含量。

通过转基因的方法将茶儿酮异构酶基因转入天山雪莲中提高芹菜素的含量(Li et al., 2006)。这些方法为提高天山雪莲次生代谢产物的含量奠定了基础。

除以上方法外，利用农杆菌介导方法转化获得毛 状根，然后通过发酵培养毛状根生产黄酮类次生代谢产物，发现紫丁香苷和高车前素(4,5,7-三羟基-6甲氧基黄酮)分别高于野生植物，而毛根部的芦丁含 量却相对较低(Fu et al., 2006) 。说明通过毛状根培养生产雪莲次生代谢产物也是一条重要的途径。

3.5其他

除上述应用于天山雪莲的分子生物技术的研究外，根据GenBank收录的sikSAD基因序列，采用反转录PCR技术从天山雪莲中克隆了sikSAD基因，构建表达载体，将其转入到酿酒酵母菌株中，在酒精胁迫实验中对其进行低温和酒精耐受性分析，发现，其能耐受一定浓度的酒精，并且耐受能力比非转基因酿酒酵母提高了十几个百分点(程晨等, 2011)。该研究用分子技术改造酿酒酵母，为工业生产提供高 质量的酿酒酵母奠定实验基础。

4天山雪莲研究的其他生物技术

除上述应用于天山雪莲的生物技术外，在育种、天山雪莲和内生真菌的相互作用及天山雪莲质量控制等方面也有不同程度的研究。

4.1育种

中科院新疆生理技术研究所的研究人员以雪莲的下胚轴茎段为外植体，用含有不同浓度秋水仙素的培养基进行诱导，培育出四倍体的天山雪莲。该新 技术将植物组织培养技术与多倍体育种技术相结合，不仅缩短了育种周期，还提高了雪莲活性成分的含量，为天山雪莲的品种选育提供了新方法。

4.2内生真菌

内生真菌具有丰富的物种多样性，并可能对宿主植物的适应性发挥重要作用。对于天山雪莲和内生真菌的相互作用的研究已有不少。对天山雪莲根中分离出了49株内生真菌，其中的48株被识别为柱孢属并分成14类。柱孢属sp.是优势种与天山雪莲隔离，其次是茎点霉属Phoma sp.和镰刀菌素sp. (吕瑞凤等, 2010）。分析证明，天山雪莲中内生真菌在物种中具有多样性，并且是抗菌药物的潜在来源。从天山雪莲体内分离出 40 种内生真菌，其中根中DSE真菌有9种，通过对天山雪莲内生真菌及其对宿主的作用的研究，发现真菌和宿主的生长状态不 同，最终会导致二者之间关系的变化。这些研究还正在深入的进行中。

4.3质量控制

目前已有大量学者通过高效液相色谱法对天山雪莲的指纹图谱进行研究，利用高效液相色谱法准确性、重复性好，来比较不同产地的新疆雪莲的差异，发现不同产地的天山雪莲由于受产地，气候和生态环境等的影响，化学成分一致性较好，但成分的含 量差异性较大(吕瑞凰等, 2005)。通过建立天山雪莲的高效液相指纹图谱，可快速，而简便地区分和鉴别不同产地的天山雪莲。

5总结

综上所述，生物技术应用于天山雪莲的研究，不仅可以保护天山雪莲这一高山稀有名贵药用植物，在非特定环境中大量生产天山雪莲和其药用活性成分，还可以拓宽天山雪莲除药用价值外更大的利用价值，有利于天山雪莲的利用、发展及开发。因此，生物技术在对天山雪莲甚至药用植物的研究中逐步发挥着巨大而有成效的作用。生物技术在天山雪莲的广泛应用不仅延续了其独特的药用价值，从更长远的角度来说也促进了我国药用植物的现代化和国际化。

作者贡献

荆甜蕊负责资料收集和论文撰写；徐思雅负责 资料收集、论文修改和校对；郭斌、尉亚辉负责论文 修改和指导。

致谢

本项目由国家自然科学基金项目(31000144)陕西 省教育厅科研计划项目(12JK0846)和陕西省博士后 科研项目共同资助。

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