人乳汁是婴儿最重要的食物来源，对婴儿的健康发育特别是后天免疫的形成有着至关重要的作用。MicroRNAs (miRNAs)是一种内源性的非编码RNA，由22个左右的核苷酸组成，通过在转录后水平抑制靶mRNA的翻译而广泛参与生理和病理反应过程的调节(Bartel, 2009)。Kosaka等(2010)在人乳中发现了大量miRNAs的存在。由于乳汁的成分复杂，在不同的存放环境中，人乳汁中的miRNA的完整性和稳定性都会受到一定的影响。

为了探究乳汁中miRNAs的稳定性，本研究对人乳汁作设计了4种处理：室温孵育、反复冻融、煮沸和RNA酶处理，利用荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测miRNAs的相对表达量变化，试图了解乳汁中内源性的miRNAs及外源性miRNAs在不同处理条件下的稳定性。

1结果与分析
研究显示室温孵育4 h后，乳汁中的内源性miRNAs稳定在初始量的在37%至70%范围内，到8 h和24 h后分别降至初始量的16%和8%；而外源性miRNA在孵育0.5 h后就降到了初始量的0.13% (图1A)。在-20℃冻融处理1~6次后，乳汁中的内源性miRNAs稳定在25%~46%的水平，但外源性miRNA在冻融1次后就降到了初始量的0.95% (图1B)。在100℃处理10 min后，乳汁中的内源性miRNAs的表达量降到初始量的29%，而外源性miRNA则降解到初始量的0.63% (图1C)。RNA酶A/T1在37℃消化1 h后，乳汁中的内源性miRNAs降到了初始量的49%，而外源性miRNA在初始量的0.69% (图1D)。

图1人乳汁中内源性miRNAs和外源性miRNAs在体外不同处理环境下的相对表达量变化 Figure 1 The changes of relative expression between endogenous miRNAs and exogenous synthetic miRNAs under various harsh conditions

上述结果表明，在4种体外不同处理条件下，乳汁中内源性miRNAs和外源性miRNA均被显著性降解(p<0.01)。内源性miRNAs降解为初始量的25%~70%之间，而外源miRNA则急剧降解至初始量的0.06%~0.96%。研究结果说明人乳汁中内源性miRNAs较外源性miRNAs在体外不同环境中具有更好的稳定性。

2讨论
本研究结果显示人乳汁在经过常温存放，-20℃反复冻融和煮沸处理后其内源miRNAs仍然存在较高的表达量，这与Mitchell等(2008)在血液中证实miRNAs可以稳定表达的研究相似。我们的研究结果显示人乳汁中的内源miRNAs较外源miRNAs具有更强的抵御RNA酶A/T1降解的能力，这与Kosaka等(2010)证明人奶miRNA可以抵抗RNA酶降解结果相同。根据Pegtel等(2010)的报道，这些稳定存在的miRNAs可能包被于Exosome中。Exosome是一类直径约30~100 nm (张尧和吴小候, 2008)广泛存在各种体液中的小囊泡体(Lakkaraju and Rodriguez-Boulan, 2008)，可以保护其中包被的miRNA、mRNA和蛋白质，还能参与细胞之间信息的传递和物质的交换(Mathivanan et al., 2010)，甚至在植物性食品和人体之间进行交流(Zhang et al., 2012)。显然，婴儿喝下母乳后，其中含有的免疫相关miRNAs很可能通过这种保护机制抵御胃肠道的消化而直接被机体吸收，进而对婴儿自身免疫系统的完善发挥其调控作用。本研究结果进一步为核酸营养和母乳喂养重要性提供了佐证。

3材料与方法
3.1样本采集 
人乳汁(20~50 mL)取自4名产后60 d处于泌乳期的健康妇女((30±0.9)岁, 第一胎，自然分娩)，用手动吸乳器收集乳汁于无菌离心管中。收集好的样品于-80℃冻存，用于研究分析。

3.2样本处理 
将人乳汁冰上解冻后混合均匀，取等量样本分别模拟储存：(1) 26℃孵育0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h和24 h；(2) -20℃和室温反复冻融6次；(3) 100℃孵育10 min，和模拟体内消化：(4) RNase A (0.16 µg/µL)和RNase T1 (0.4 U/µL) (美国Fermentas公司) 37 ℃孵育1 h。样本在处理前都加入100 fM外源性miRNA ath-miR-159a-3p (广州锐博公司人工合成的miRNA，与人体内miRNA无同源性)，作为内源性miRNAs的对照。样本处理结束后，为校正不同样本在RNA抽提以及后续实验中的误差，在乳汁变性后(RNA抽提过程中加入裂解液后)加入100 fM外源参考基因cel-miR-2-3p和cel-lin-4-5p。

3.3 qRT-PCR检测人乳汁中免疫相关miRNAs
qRT-PCR检测人乳汁中9个内源性的免疫相关miRNAs和一个外源miRNA (ath-miR-159a-3p)的相对表达量，miRNAs的引物即为其成熟体本身，序列查自miRBase 18.0数据库(http://www.mirbase.org/)。荧光定量参照SsoFast™ EvaGreen® Supermix说明书(美国Bio-Rad公司)进行操作。qRT-PCR反应体系为10 µL：5 µL SsoFast EvaGreen supermix，0.5 µL引物，1 µL的cDNA模板。PCR循环参数为：98℃ 30 s，98℃ 1 s，60℃ 5 s，循环45次，PCR扩增后进行熔解曲线分析，温度以0.2℃/s的速度缓慢从65℃递增到95℃，每个miRNA做3个技术重复，每板设置一个阴性对照。检测仪器为Bio-Rad的CFX96™实时PCR检测系统(美国Bio-Rad公司)。以外源性的miRNAs cel-miR-2-3p和cel-lin-4-5p作为校正不同样品的参考基因，采用2-ΔΔCt法计算miRNAs相对表达量差异，并采用SigmaPlot软件(美国Systat公司)进行Student - t检验。

作者贡献
周琦负责试验设计和文章的写作；王晓艳在实验操作中提供帮助和指导；李青芝负责实验样本的采集工作；王滔在本论文数据处理方面做了大量工作；蒋岸岸在本论文写作及修改上面做了大量工作。

致谢
本研究获得国家自然科学基金项目(30901024)资助。作者感谢四川农业大学动物遗传研究所为本试验开展提供实验室和仪器；本论文的完成要感谢李明洲和官久强等的热情帮助。在此对他们表示感谢！

参考文献
Bartel D.P., 2009, MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions, Cell, 136(2): 215-233 http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002 

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Lakkaraju A., and Rodriguez-Boulan E., 2008, Itinerant exosomes: Emerging roles in cell and tissue polarity, Trends in Cell Biology, 18(5): 199-209  http://dx.doi.org/10.1016/j.tcb.2008.03.002 

Mathivanan S., Ji H., and Simpson R.J., 2010, Exosomes: Extracellular organelles important in intercellular communication, Journal of Proteomics, 73(10): 1907-1920 http://dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2010.06.006  http://dx.doi.org/10.1074/mcp.M900152-MCP200 

Mitchell P.S., Parkin R.K., Kroh E.M., Fritz B.R., Wyman S.K., Pogosova-Agadjanyan E.L., Peterson A., Noteboom J., O'Briant K.C., Allen A., Lin D.W., Urban N., Drescher C.W., Knudsen B.S., Stirewalt D.L., Gentleman R., Vessella R.L., Nelson P.S., Martin D.B., and Tewari M., 2008, Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection, PNAS, 105(30): 10513-10518  http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0804549105 
 
Pegtel D.M., Cosmopoulos K., Thorley-Lawson D.A., Eijndhoven M.A.J.V., Hopmans E.S., Lindenberg J.L., Gruijl T.D.D., Würdinger T., and Middeldorp J.M., 2010, Functional delivery of viral miRNAs via exosomes, PNAS, 107(14): 6328-6333
http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0914843107 
 
Zhang L., Hou D., Chen X., Li D., Zhu L., Zhang Y., Li J., Bian Z., Liang X., Cai X., Yin Y., Wang C., Zhang T., Zhu D., Zhang D., Xu J., Chen Q., Ba Y., Liu J., Wang Q., Chen J., Wang J., Wang M., Zhang Q., Zhang J., Zen K., and Zhang C.Y., 2012, Exogenous plant MIR168a specifically targets mammalian LDLRAP1: Evidence of cross-kingdom regulation by microRNA, Cell Research, 22: 107-126  http://dx.doi.org/10.1088/1674-4527/12/7/008 

Zhang Y., and Wu X.H., 2008, The biological characteristics of exosome and its role in immune regulation, Chongqing Yixue (Chongqing Medical Journal), 37(18): 2111-2113 (张尧, 吴小候, 2008, Exosome的生物学特性及其在免疫调节中的作用, 重庆医学, 37(18): 2111-2113)