牡丹归芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)牡丹组(Sect. Mutan DC)，一直以来都是作为中国特产的重要观赏植物和药用植物而广为人知，并得到人们的喜爱。近年来，牡丹籽油提取和成分分析的研究发现，牡丹籽具有较高的出油率，牡丹籽油具有较高的营养价值，特别是其亚麻酸含量远远高出了目前主要的食用植物油(邓瑞雪等, 2010; 李凯等, 2012)。因此，牡丹有望成为集观赏价值、药用价值和油用价值为一身的重要经济植物。 中国牡丹主要有中原、西北、江南和西北四大品种群，而江南牡丹品种群中的‘凤丹’系列，是以杨山牡丹(Paeonia ostii)为主发展演化而来的品种(李嘉珏等, 2011)，具有适应性强，对土壤条件要求不高，栽培管理相对粗放，且结实率较高的特点，成为目前国内主要的的药用和油用栽培牡丹品种。

近十多年来，RAPD、SSR、ISSR、AFLP 和SRAP 等分子标记技术已逐渐应用于牡丹种质资源分类鉴定(Hosoki et al., 1997; 索志立, 2008)、亲缘关系研究(孟丽和郑国生, 2004; 苏雪等, 2006; 侯小改等, 2006)、遗传多样性研究(龚洵等, 2003; 杨淑达等, 2005; Yuan et al., 2012)、指纹图谱构建(朱红霞, 2004)及杂种鉴定(Yuan et al., 2010; 索志立等, 2004; 2005; 吴蕊等, 2011; 王佳等, 2006)。

SRAP标记已在观赏植物遗传多样性和遗传图谱构建研究中得到广泛应用, 如在石斛(樊洪泓等, 2006)、石蒜(袁菊红等, 2007)、百合(陈琼等, 2007)、桂花(李梅等, 2009)、菊花(张飞等, 2009; Zhang et al., 2010)、安祖花(于翠等, 2012), 莲(杨美等, 2012)中都有相关报道。目前SRAP已经应用于牡丹品种的分类与杂交新品系鉴定(Han et al., 2008; 郝青等, 2008)。

本课题组已经以‘凤丹’为母本，配制了多种的杂交组合，获得了不同的杂交群体，所以本实验以‘凤丹’基因组DNA为模板，探讨SRAP-PCR反应体系中5种因素对扩增的影响，以期获得‘凤丹’SRAP的最优反应体系，为今后课题组进行牡丹连锁遗传图谱构建以及遗传多样性研究提供技术支撑。

1结果与分析
1.1‘凤丹’SRAP-PCR反应体系的正交试验
‘凤丹’的SRAP反应体系中5因素4水平组合的正交试验(表1)。优化后“凤丹”的SRAP-PCR反应体系扩增结果(图1)：其中组合1没有扩增出条带；组合2、5、6、8、9、10、13、15扩增效果较差，谱带弱且多态性低；组合7、12、14扩增出的谱带多态性较高，但谱带强度和主带较差；组合3、4、11、16扩增的结果最好。所以我们进行单因子试验优化体系：0.500 U Taq酶，60 ng模板DNA, 3.000 mmol/L Mg²⁺, 0.250 mmol/L dNTPs，0.400 μmol/L引物(组合16)。 

表1 ‘凤丹’SRAP-PCR 反应体系的正交试验设计表L16(45) Table 1 L16 (45) orthogonal design diagram for SRAP-PCR reaction system in paeonia ostii

图1 不同反应体系中‘凤丹’基因组DNA的SRAP-PCR扩增结果(引物: Me2-Em10) Figure 1 SRAP-PCR amplification results of genomic DNA from paeonia ostii in different reaction systems (primer: Me2-Em10)

 
1.2‘凤丹’SRAP反应体系的优化
1.2.1不同Mg²⁺浓度对SRAP扩增的影响
Mg²⁺通过调节Taq聚合酶的活性影响PCR扩增结果，Mg²⁺浓度为2.000 mmol/L、2.500 mmol/L和3.000 mmol/L时条带较少、较弱且条带不清晰；浓度为1.500 mmol/L时达到较好的扩增效果(图2)。
 

图2 不同Mg2+浓度、dNTP浓度的SRAP扩增结果 Figure 2 The amplification results of SRAP with different concentrations of Mg2+ and dNTP

1.2.2不同dNTP浓度对SRAP扩增的影响
比较了0.100 mmol/L、0.150 mmol/L、0.200 mmol/L、0.250 mmol/L dNTP浓度对扩增结果的影响，结果表明：在各dNTP浓度下，都能扩增出条带，但dNTP浓度较低(0.100 mmol/L, 0.150 mmol/L)时，扩增条带少，且条带较弱。dNTP浓度以0.250 mmol/L较为适宜，条带稳定且清晰(图2)。
 
 
1.2.3不同引物浓度对SRAP扩增的影响
引物浓度对牡丹扩增结果影响也较大，在引物浓度为0.200 μmol/L和0.300 μmol/L时扩增条带较少且不清晰；在0.400 μmol/L 时条带也较弱；在0.500 μmol/L时扩增效果最好(图3)。 
 

图3 不同引物浓度、模板DNA浓度的SRAP扩增结果 Figure 3 The amplification results of SRAP with different concentrations of primers and template DNA

1.2.4不同模板DNA浓度对SRAP扩增的影响
模板DNA浓度不能太低，反应体系中模板DNA在30 ng时得不到有效扩增；在60 ng时条带清晰，多态性高；而大于90 ng时条带反而较弱(图3)。
 
1.2.5不同Taq酶浓度对SRAP扩增的影响
在20 μL反应体系中，使用0.500 U、1.000 U、1.500 U、2.000 U的Taq DNA聚合酶均能扩增出条带，0.500 U 用量时扩增的条带较弱，而1.500 U、2.000 U用量时非特异性扩增多，背景不清，1.000 U的用量较好，条带清楚(图4)。
 

图4 不同Taq酶浓度的SRAP扩增结果  Figure 4 The amplification results of SRAP with different concentrations of Taq polymerase

 
从上述实验结果中筛选牡丹SRAP的优化反应体系为：总体积为20 μL, Taq聚合酶浓度为1.000 U；模板DNA浓度为60 ng；Mg²⁺浓度为1.500 mmol/L；dNTPs浓度为0.250 μmol/L; 引物浓度为0.500 μmol/L。
 
1.3‘凤丹’SRAP-PCR反应引物筛选
通过优化后的反应体系，对500对引物组合进行扩增，从中筛选出120对多态性好，且谱带清晰的引物组合用于后续实验，扩增结果(图5)。
 

图5 SRAP引物筛选的扩增结果(引物: Me23/ Em11-Em20) Figure 5 The amplification results of SRAP primers screening (primers: Me23/ Em11-Em20)

2讨论
基于PCR反应开发的SRAP分子标记同样受到反应条件和扩增程序变化及物种不同的影响，而利用正交试验方法能考察各因素之间的相互效应，避免单因素实验结果的不足，从而迅速获得满意的试验结果(邹小云等, 2010)。因此，在构建牡丹遗传图谱前进行‘凤丹’的SRAP-PCR反应体系的优化是非常必要的。
 
我们在牡丹SRAP-PCR正交试验的基础上，分别进行单因子优化试验，研究发现五个因素对SRAP扩增结果的影响具有差异，影响最显著的因素是Mg²⁺浓度，其次是引物浓度，这与苏美和和赵兰勇(2012)的试验结果不同，推测可能是因为所用牡丹材料的差异导致的结果。
 
我们结合单因子优化实验最终确定了‘凤丹’的SRAP-PCR最佳反应体系为：反应体系总体积20 μL, 含10×PCR Buffer，Mg²⁺ 1.500 mmol/L，dNTPs 0.250 μmol/L、引物0.500 μmol/L、模板DNA 60 ng、Taq DNA聚合酶1.000 U。利用优化后的SRAP-PCR反应体系，我们筛选出了120对多态性好、谱带清晰的引物，这将为今后开展牡丹的遗传多样性、油用和观赏牡丹遗传连锁图谱构建以及新品种的鉴定等方面的研究奠定了基础。
 
3 材料与方法
3.1 供试材料与试剂
供试材料为保存于上海植物园科研中心牡丹苗圃的江南牡丹品种‘凤丹’。实验用的Taq DNA聚合酶、dNTPs以及100 bp DNA marker购自TaKaRa公司，用于SRAP 反应的引物等试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司，经初步筛选，确定Me2 (TGA GTC CAA ACC GGA GC)和Em10 (GAC TGC GTA CGA ATT CAG)作为此次正交试验的固定引物。
 
3.2‘凤丹’基因组DNA提取
采用改良CTAB法提取‘凤丹’嫩叶的DNA，琼脂糖凝胶电泳(1.0%)检测后，利用分光光度计(NANODROP2000C)检测基因组DNA的纯度和浓度，最后将DNA稀释至60 ng/μL，保存在-20℃冰箱。
 
3.3反应体系正交试验
采用正交设计L₁₆(4⁵)进行试验，反应组合(表2)，并进行3次重复。 
 

表2 SRAP-PCR反应的主要影响因子浓度梯度 Table 2 Factors and levels of SRAP-PCR reaction

3.4 SRAP-PCR扩增程序
‘凤丹’SRAP-PCR的扩增程序参照Li和Qurios (2001)的标准程序并做出调整：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，37℃复性50 s，72℃延伸1.5 min，8个循环反应；94℃变性40 s，50℃复性50 s，72℃延伸1.5 min, 32个循环反应；72℃延伸10 min，4℃保存。
 
3.5 SRAP-PCR反应体系单因子试验
在其它反应条件不变的情况下，研究了20 μL反应体系中不同浓度Mg²⁺，dNTPs, Taq DNA聚合酶, 引物以及模板DNA浓度(表2)对SRAP扩增的影响。引物同上，试验设2次重复。
 
3.6 SRAP-PCR多态性引物的筛选
在正交试验结果分析的基础上，从正向引物(Me)25个和反向引物(Em)20个共500对引物组合中，筛选适合江南牡丹‘凤丹’的引物。所用PCR扩增体系为正交设计所得出的最佳体系。
 
作者贡献
李健、胡永红、秦俊和蒲立栋是本研究的实验设计和实验研究的执行人；李健和胡永红完成数据分析，论文初稿的写作；韩继刚、刘炤、蒲立栋参与实验设计，试验结果分析；奉树成指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
 
致谢
本研究由上海市科学技术委员会和上海市绿化局(11ZR1436100, 11391901101, F122431)资助。
 
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