Analysis on The Difference of Metabolites in Rapeseed with Different Oil Content

Chang Tao ¹　Li Gang ²　Guan Mei ¹　Zhang Zhenqian ^1*

1 Agricultural College of Hunan Agricultural University, Southern Grain and Oil Crop Collaborative Innovation Center, Changsha, 410128; 2 Agricultural College of Yongzhou Vocational and Technical College, Yongzhou, 425100

* Corresponding author, zzq770204@163.com

Abstract　High oil content rape can increase oil production per unit area because it was widely concerned. But the difference of metabolites in different oil content rape seeds was not clear. In this research, the metabolites of two near isogenic lines of Brassica napus with different oil content were analyzed by uplc-q-TOF/MS. The results showed that 46 kinds of differential metabolites were screened out, among which 24 were related to the pathway of oil synthesis, 14 to the pathway of fatty acid synthesis, 3 to the pathway of sugar metabolism, 2 to the pathway of vitamin metabolism, 1 to the pathway of hormone metabolism, and 2 to the pathway of anthocyanin metabolism. The fatty acids such as sterol, anthocyanin, stearic acid and linoleic acid were higher and linolenic acid was lower. The results were helpful to reveal the mechanism of oil synthesis in rape seeds and provide reference for high oil content rapeseed breeding.

Keywords　ape, metabonomics, oil content, UPLC

油菜是中国第一大油料作物，占自产植物油总量的57%以上(刘成等, 2019)。中国是食用植物油消费第一大国，每年需从国外大量进口，自给率不足35%(张鑫等, 2020)。2019年中国进口菜油量已超过世界油菜总进口总量的40%，单纯依靠进口，无法满足中国不断增加的食用油需求(姚林, 2020)，提高中国菜油自产供应量刻不容缓。提高菜油供应量可通过扩大种植面积和提高单位面积产油量两个途径，但目前中国油菜种植面积不断萎缩，亩产增长幅度有限，而菜籽含油量与国外主栽的品种相比还有4%~6%的差距，增长空间较大。如果生产中的油菜品种含油量增高，则能有效缓解中国食用油自给不足的现状(洪波等, 2019)。因此高含油油菜对提高中国食用油自给水平十分重要。

代谢组学采用先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法，是代谢组学研究的基本方法(Erp et al., 2014)，使用代谢组学分析样本不仅能系统的分析主要差异物的影响，还能对一些常规分析方法难以检测到的物质进行检测，已成为分析生物间生理差异的重要手段(钱俊青等, 2010)。目前将代谢组学应用于作物的研究有很多，如Fumagalli等(2009)进行了两种不同基因型的水稻应答干旱胁迫和盐胁迫的代谢组学研究，分析两种非生物胁迫时两种基因型水稻表现出氨基酸和糖类积累。Hernandez等(2007)利用GS-TOF-MS对豆科植物的根部进行了代谢轮廓的分析比较，并鉴定了许多与磷胁迫有关的代谢产物，氨基酸、多元醇和糖类在对磷胁迫的应答时含量升高。近年来，代谢组学在油菜中的研究也逐渐增多。研究表明，高含油油菜种皮中的可溶性蛋白含量(常涛等, 2019)普遍较低。但这些差异没有系统的从各个代谢通路上对含油量的差异作出解释。将代谢组学应用于植物含油量的研究较少，在油菜中尚无与含油量相关的研究。

油菜种子在成熟过程中的油脂积累会受代谢物质的影响，对不同含油量的油菜种子进行代谢组学分析，能够从代谢通路上分析油菜种子在成熟过程中代谢物质发生的变化，揭示了油脂合成的本质。本研究以2个不同的含油量甘蓝型油菜近等基因系授粉后20~35 d种子为材料，分析其代谢物差异，为高含油油菜育种提供参考。

1结果与分析

1.1差异代谢物质鉴定

将QC样本的总离子流图进行谱图重叠(n=12) (图1)。为了更加详细地了解代谢物对油菜含油量的影响，对2组油菜种子的代谢物进行了UHPLC-Q-TOF/MS分析。经过峰提取和匹配后，共得到11 473个化合物特征离子，其中9 421个在QC样品中RSD＜30%的特征离子用于下一步分析。

图1 质控血浆样品总离子流(n=12) Figure 1 Total ion current (TIC) chromatograms of quality control (QC) plasma samples (n=12)

PCA分析显示2组样品之间被明显的区分开来，表明不同含油量油菜种子的代谢物发生了明显的变化(图2)。以低含油材料为对照，共筛选出1.2>FC>0.83的显著差异代谢物46种，将筛选所得差异代谢物输入KEGG数据库(www.kegg. jp/kegg/mapper.html)查询代谢通路。

图2  电喷雾电离模式下油菜种子样本的PCA得分 Figure 2 Principal component analysis (PCA) scoreplots of the rapeseed samples in the electros-pray ionization mode

1.2 脂质代谢通路代谢物的差异

脂质代谢通路种中鉴定到24种差异代谢物(表1)。高含油油菜中有14种代谢物较高，10种代谢物较低。本研究中检测脂质代谢通路中的主要差异物包括甾醇、脂肪酮、脂肪醇、乙酰乙酸盐等物质。与对照相比，高含油油菜中脂肪酮、脂肪醇、乙酰乙酸盐的含量显著较高，固醇类物质的含量显著较低。高含油材料中两种脱氧皮质醇和硬质酰胺表达量均较高，皮质醇和脂酰胺是油脂合成中的重要物质(王晓红等, 2018)，其含量增高可能对含油量的提高造成影响。

表1 高-低含油量油菜在脂质代谢通路中的显著性代谢差异物 Table 1 Significant metabolism difference between low oil and high oil rape in lipid metabolism pathway 注: VIP: 空间投影重要性 Note: VIP: variable importance for the projection

1.3脂肪酸代谢通路代谢物的差异

脂肪酸代谢通路种中鉴定到14种差异代谢物(表2)。高含油油菜中有5种脂肪酸上调，9种下调。与对照相比，高含油油菜中下调脂肪酸的种类较多，但多为碳原子数较多且不饱和程度高的脂肪酸，与油菜油脂积累的主要脂肪酸如硬脂酸和亚油酸等均以上调为主。表明油菜种子中的含油量主要与几种关键的脂肪酸相关。

表2 高-低含油量油菜在脂肪酸代谢通路中的显著性代谢差异物 Table 2 Significant metabolism difference between low oil and high oil rape in fatty acid metabolic pathway 注: VIP: 空间投影重要性 Note: VIP: variable importance for the projection

1.4其它代谢物的差异

本研究还鉴定到了差异代谢物包括：糖代谢通路3种、维生素代谢2种、激素1种、花青素2种(表3)。对照相比，高含油油菜中花青素、马钱子苷五乙酸含量上调，含量是高含油材料的2倍以上。赤霉素、维生素E、糖酸等物质下调。花青素、马钱子苷五乙酸均有较强的抗寒氧化性(罗玉燕等, 2010)，而赤霉素有促进作物提早成熟的作用，其含量变化可能影响了种子的活性，从而影响油脂积累。

表3 高-低油量油菜其他显著性代谢差异物 Table 3 Other significant metabolism difference foreign bodies between low oil and high oil rape 注: VIP: 空间投影重要性 Note: VIP: variable importance for the projection

2讨论

本研究利用代谢组学检测不同含油量油菜近等基因系材料授粉后20~35 d种子中代谢物的差异，两个材料在脂质代谢、脂肪酸代谢、花青素和糖代谢方面有显著差异。其中，高含油油菜中脂肪酮、脂肪醇、乙酰乙酸盐的含量显著较高，两种脱氧皮质醇和硬质酰胺表达量均较高，固醇类物质的含量显著较低。高含油油菜中下调脂肪酸的种类较多，但多为碳原子数较多且不饱和程度高的脂肪酸，与油菜油脂积累的主要脂肪酸如硬脂酸和亚油酸等均以上调为主。高含油油菜中花青素、马钱子苷五乙酸含量上调，含量是高含油材料的2倍以上。赤霉素、维生素E、糖酸等物质下调。本研究可为高含油量油菜育种提供参考。

研究发现脂质代谢通路中脂肪酮、脂肪醇、乙酰乙酸盐的含量较高，而固醇类物质的含量较低。固醇有多种不同的生物学功能，一方面作为细胞膜的成分及合成脂肪酮、脂肪醇等物质，另一方面是作为乙酰辅酶A转化成油脂的中间物质，植物体内以乙酰辅酶A为原料，经缩合等反应产生甲羟戊酸，再经一系列磷酸化反应生成的异戊二烯单位缩合产生C30烯，再经环化生成固醇类物质。本研究中，高含油材料中固醇类物质整体下降原因可能有二：一是转化成为细胞膜，增强了细胞膜的活性，促进了油脂合成和积累，二是直接作为乙酰辅酶A转化为油脂的中间物质参与了脂质合成。

本研究发现高含油油菜种子中花青素高于低含油材料。孙月娥等(2010)研究表明，植物体内的脂肪在氧化条件下会被脂肪酶分解为甘油、单双甘油脂和游离脂肪酸等物质，进而被消耗。本研究中，低含油油菜可能由于在种子发育后期脂肪降解酶活性增高，脂肪快速降解从而导致了含油量下降。同时，高含油油菜中花青素含量显著上升，可能是高含油油菜种子中花青素含量较高，导致种子中抗氧化程度提升，抑制了脂肪酶的活性，减少了脂肪的分解。

代谢物质差异还会影响菜油品质。脂肪酮、脂肪醇等物质均是脂肪酸还原产生(曾琼等, 2013)，其含量提高可能是脂肪酸含量增加所致。亚油酸是不饱和脂肪酸代谢的关键物质，可转化为γ-亚麻酸和花生烯酸等不饱和脂肪酸，本研究中亚油酸含量增高而γ-亚麻酸降低，可能是因为高含油材料积累的亚油酸尚未完全转化所致。研究表明(Ghalanbor et al., 2008)，花青素是当今人类发现最有效的抗氧化剂，也是最强效的自由基清除剂。高含油材料中花青素含量较高，可能是其抗氧化能力强，降低了细胞受到了损害，促进油脂积累所致。而维生素E可抑制过氧化脂反应(何晨等, 2020)，其含量下降可能是油脂含量的增加以致消耗过多，最终导致品质改变。

在本研究中，还鉴定到乙酰乙酸盐、游离脂肪酸、马钱子苷五乙酸等常规分析方法难以检测到的物质，这些物质均对含油量具有重要影响。

3材料与方法

3.1试验材料

甘蓝型高含油油菜(Brassica napu.L)近等基因系材料，两材料父母本相同但含油量差异显著，含油量分别为48%和38%，由湖南农业大学油料所提供。

3.2方法

每组材料取自交套袋授粉后20~35 d油菜种子，各6个重复，存于-80℃保存备用。采用ACQUITY UPLC CSH C18 column (100 mm×2.1mm, 1.7μm, Waters, UK)进行色谱分离，具体操作及参数参照陈勤操等(2019)。

3.3数据处理与分析

UHPLC-Q-TOF/MS分析获得的原始图谱分别采用 DA Reprocessor software (Agilent Tech., Santa Clara, CA)和Mass Profiler Professional 13.0 软件(Agilent Tech., Santa Clara, 美国)进行峰匹配和积分。主成分分析(PCA)使用Simca-P 11.5软件。Tukey s-b(K)检验使用 PASWstat software (版本18.0, 美国)软件。

采用FC分析T检验及对高含油材料组和低含油材料组的数据进行单变量分析(杨秀娟等, 2019)，可筛选出不同含油量油菜的差异代谢物，以1.2>FC>0.83，且p＜0.05作为筛选标准，FC指高含油油菜相对于低含油材料的变化倍数，本试验结果表明，高含油与低含油材料可明显聚为两类，表明所筛选的代谢物合理。

作者贡献

张振乾是本研究的实验设计和实验研究的执行人；常涛完成数据分析，李纲论文初稿的写作；张振乾参与实验设计，试验结果分析；官梅是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2015CB150206;SQ2018ZD080068:SYKB201701)资助。

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