大白菜(Brassica rapa L. ssp. pekinensis)是十字花科芸薹属的一种常见作物，在中国不仅有悠久的栽培历史，且生态类型多样，分布面积很广。大白菜球色主要包括白色、桔红色和黄色，彩色大白菜不仅色泽艳丽美观，而且营养价值较高。其中桔红心大白菜比普通白菜具有较高的Vc和类胡萝卜素含量，在类胡萝卜素总量上桔红心大白菜是普通白菜的约5~10倍，并且发现番茄红素仅存在于桔红心大白菜中。在实际育种过程中，开发出与桔红心基因紧密连锁的共显性分子标记并应用于标记辅助选择育种(MAS)对于提高工作效率、缩短育种年限有着重要的现实意义。通过紧密连锁的SSR标记可以准确的定位or基因，为未来将要进行的基因功能研究及克隆奠定基础，具有一定的理论价值。

对于桔红心性状遗传规律的研究，已有报道表明其由一对隐性单基因控制(张德双等, 2003; Matsumoto et al., 1998)。近些年来，与大白菜or基因连锁的分子标记被相继开发出来，已经得到了几个RAPD标记和由其转化而来的SCAR标记(刘秀村等, 2003; 王国臣等, 2007; Zhang et al., 2008)。Matsumoto等(1998)开展了大白菜桔红心基因方面的研究，阐明了大白菜桔红心性状为一对隐性基因控制的简单遗传并通过RFLP技术将此基因定位于1号连锁群上，距离最近的RFLP标记约17 cM。Zhang等(2008)找到了3个遗传距离分别为10 cM、5 cM和10 cM的SCAR标记，并通过2个锚定标记将or基因初步定位于9号连锁群末端。前人报道RAPD、SCAR等显性标记由于无法区分纯合(oror)和杂合(Oror)基因型，在应用于实际的辅助选择育种中时难免会受到一定程度的限制。开发共显性的SSR标记可以很好地克服上述缺陷，为育种者选择目标基因型提供有力手段。并且由于SSR标记是基于基因组序列设计的特异性引物，可以将与之相连锁的基因锚定与染色体特定位置，这可以更加方便我们在不同研究结果之间进行对比与整合。

本试验通过开发与大白菜桔红心or基因连锁更为紧密的共显性SSR标记，进而相对精确地定位此基因，利用SSR标记的优越性为以后该基因的精细定位与克隆提供一定的理论依据，并为标记辅助选择育种提供手段。
 
1结果与分析
1.1桔红心性状的遗传分析
在群体结球期，对双亲、F₁和F₂剖球调查性状。经鉴定Chiifu心叶为白色，07A163 心叶为桔红色，120株F₁代单株心叶均表现白心，试验组合Chiifu×07A163群体F₂共600株，经统计其中白心446株，桔红心154株，符合3:1的孟德尔遗传分离规律(χ²=0.142 ＜χ²_0.05=3.841)，表明桔红心性状为一对隐性基因控制的简单遗传(表1)。

表1 大白菜桔红心性状在不同世代的分离情况 注: *: 在显著性水平0.05、自由度为1情况下的卡方值, χ20.05=3.841 Table 1 Segregation in different generation of orange head inner leaf traits in Chinese cabbage Note: *: χ2  in α=0.05  and  n=1, χ20.05=3.841

1.2 SSR标记分析
1.2.1亲本间多态性的筛选
从合成的500对SSR引物中，挑选其中的430对可以较好覆盖大白菜10条连锁群的引物用于亲本间多态性的筛选。这些引物均能在双亲间扩增出稳定清晰的条带，经统计共扩增出约630条谱带，其中有228对引物可以在双亲间揭示出差异。由于所用SSR引物均为针对大白菜基因组设计的特异性引物，所以在亲本间保持了较高的多态性比率。

1.2.2 基因池的分离体分组混合分析法(BSA)分析
在双亲间揭示出多态性的SSR引物，对基因池进行BSA分析，通过筛选，共发现6对引物可以在桔红心亲本07A163和桔红心基因池间扩增出清晰的同等大小谱带，即认定可能与or基因存在连锁关系。即使连锁距离较远的标记比较容易发生重组，由于构建了多个混合池，组成某一池的所有单株仍有可能都不发生交换，这样就可以尽量避免遗漏掉较远的标记，利于早期确定目标基因位于哪条连锁群上，加快试验进度。
 
1.2.3单株验证及遗传距离估算
随即选取20株桔红心单株，利用初选的6对引物对其进行验证，剔除不连锁的标记，发现ENA21、sau(N)033、与or基因表现出连锁关系，在154株携带纯合隐性基因(oror)的单株中对得到的标记进行验证，它们发生交换的单株数分别为64株和61株，计算得到上述2个标记的交换率分别为21.3 %和20.3 %(表2)。

表2 3个SSR标记在F2代桔红心单株中的分离 Table 2 Segregation of 3 SSR markers in 154 orange head inner leaf individuals of F2 population

得到的2个标记经分析得知遗传距离分别为25.4 cM和24.4 cM，来自于大白菜A9连锁群。为了进一步找到连锁更为紧密的标记，在A9上位于标记ENA21、sau (N)03 25 cM附近区域内选取SSR标记，共选出5对引物sau (C) 343、sau (C) 119、sau (N) 129、sau (C) 586和sau (C) 601。在亲本间这5对引物均表现出多态性，通过对154株桔红心单株进行验证，最终得到了一个连锁较为紧密的标记sau (C) 586，在亲本07A 163和基因池中扩增出一条同等大小的特异性条带，与在亲本Chiifu上得到的条带差异明显(图1)，在所有桔红心单株中只有5株发生交换，经遗传距离估算得知此标记距离or仅1.6 cM，3个标记的引物信息见表3。
 

图1 sau(C)586 在双亲以及F2 代纯合隐性单株(部分)中的扩增结果 注: M: Marker; P1 (OrOr): Chiifu; P2 (oror): 07A163; 1～28: 桔红心单株(ror); *: 重组个体 Figure 1 Amplification of sau(C)586 in two parents and homozygous or allele individuals of F2 population (only parts were shown in this figure) Note: M: Marker; P1 (OrOr): Chiifu; P2 (oror): 07A163; 1～28: orange head inner leaf individuals (oror); *: recombinants

表3 标记or基因的SSR引物及其序列 Table 3 SSR primer pairs and their sequences marked gene or

1.3连锁分析与or基因定位
使用MAPMAKER/Exp3.0对三个标记进行连锁分析，构建了一条or基因区域的局部遗传连锁图(图2)，3个标记位于目标基因的一侧，or基因被定位于A9末端，距离最近的标记1.6cM，与A基因组1号染色体相对应。标记与or基因在连锁群上的位置为ENA21-sau(N)033-sau(C)586-or。用于定位研究的约440对SSR引物虽然特异性很强，同时也保持了很高的多态性比率，但是由于目前已经开发出的引物在or基因所处染色体区域并不密集，所以造成了构建的局部连锁群并不是很均匀，标记ENA21和sau(N)033遗传距离较远，且和sau(C)586之间出现了约22 cM的间隙。

图2 or 基因区域的遗传连锁图 Figure 2 Genetic linkage map of the or locus on A9

2讨论
2.1桔红心性状的遗传特性
芸薹属作物中桔红色性状早已有研究可循，Crisp等(1975)在研究中阐述了一种可以使花椰菜发生桔红色突变的基因，并将其命名为“Or”(Orange)，在同类报道中，研究认为是一个基因突变体的产生导致花椰菜异常积累β-胡萝卜素而呈现桔红色(Dickson et al., 1988; Li et al., 2001)。Li等(2003a)对该基因进行了精细定位，同年进一步绘制了Or基因的精细物理图谱(Li et al., 2003b)。

由于桔红色营养器官令作物具有更加鲜艳的外观，赋予了它较大的经济以及食用价值，目前对于它的研究呈现越来越多的趋势。在大白菜品种中，前人研究认为桔红心性状相对于白心表现为由一对隐性基因控制的简单遗传。

Matsumoto等(1998)以“Oy”命名大白菜中桔红心基因，后来的报道中则均以“or”表示该基因。本研究中为了名称的一致性，继续将大白菜桔红心基因表示为“or”，通过对常规杂交组合Chiifu×07A163的F₁、F₂世代进行性状调查，在F₁代的120株个体中全部表现出白色球心，在600株F₂代群体中，白心与桔红心性状的分离比率为2.9:1，符合3:1的孟德尔遗传分离规律(χ²=0.142＜χ²_0.05=3.841)，再次明确了桔红心性状相对于正常白心表现出隐性遗传的特征。

2.2大白菜桔红心性状的分子标记
大白菜作为一种普遍栽培的作物，其分子标记的研究已广泛开展(Feng et al., 2009; Wei et al., 2009; Piao et al., 2004; Saito et al., 2006)，BSA研究方法更是为其提供了便捷的手段。包括抗病性、抗逆性、雄性不育与抽薹开花等一系列重要性状已经取得了相当大的研究进展，但是做为一种品质性状，结球颜色的研究仍然处于初级阶段。本试验使用Chiifu×07A163的F₂代作为研究群体，由于桔红心基因表现为隐性，在此群体中无法区分基因型OrOr和Oror的单株，故只选择纯合隐性个体构建基因池，与父母本同时进行多态性的筛选。本试验所用近440对SSR引物均来自于芸薹属植物基因组测序计划(BrGSP)，随着研究的不断深入，大量高质量的SSR标记正被陆续开发出来。本研究通过采用此项目的模式材料“Chiifu”，使其最新研究成果得以充分利用，并且由于07A163与Chiifu在形态特征上也具有较大的差异，故所选的引物在亲本间仍保持了较高的多态性比率(53%)。

控制大白菜桔红心性状的or基因为隐性，在实际育种工作中，凭借显性标记无法区分出携带or基因的杂合材料(Oror)和纯合材料(oror)，这将给制定育种计划造成一定的障碍。相比于过去所得到的一些列标记类型，诸如RAPD、SCAR等显性标记，SSR标记具有的共显性优势对于隐性or基因来说具有更大的实际应用价值(Zietkiewicz et al., 1994;Belaj et al., 2003)。本研究得到的3个SSR标记均为共显性，ENA21和sau(N)033遗传距离较远，sau(C)586则连锁较为紧密，在完善标记辅助选择育种(MAS)的基础上，通过使用简便，稳定且紧密连锁的SSR标记，相信可以为MAS的实施提供强有力的手段。
 
2.3桔红心基因or的定位研究
Zhang等(2008)利用DH群体得到了or基因的3个SCAR标记，距离最近的一个为5 cM，并通过SSR标记将or锚定于A9末端，or与较近的一个锚定标记Ni4D09的遗传距离约为30 cM，Ni4D09在本试验中同样被用来对双亲进行筛选，但由于选用的亲本材料遗传背景的差异，此引物在亲本Chiifu和07A163之间未出现多态性。Matsumoto等(1998)将or基因定位于1号连锁群上，由于其使用了不同的作图群体以及标记类型，得到了有差异的研究结果，笔者推测可能是由于导致大白菜出现桔红心突变的基因并非一种，或者是由于大白菜作物在进化过程中的某些基因片段发生易位而导致or所在区段出现在了不同的染色体上。

本研究通过3个SSR标记构建了一条局部连锁群，将or基因定位于大白菜A9连锁群末端距离标记sau(C)586仅1.6 cM的位置，对应于A基因组1号染色体，定位结果与Zhang等的研究结果相符(2008)。其中距离or较远的标记ENA21已被报道用来构建大白菜全基因组的遗传连锁图谱，通过对比本研究得到的连锁群和前人报道的A9连锁群(choi et al., 2007; Yu et al., 2009)，发现标记ENA21和Ni4D09相距非常近，仅为1-2cM，且它们均分布于or基因的同一侧，联想到ENA21距离or 25.4 cM，而Ni4D09距离or约为30 cM(Zhang et al., 2008)，故推测与Zhang等定位的or可能为同一基因。

对于筛选的SSR引物，虽然挑选时尽量使其可以均匀覆盖全基因组，但是在所定位的or基因区域仍然缺乏较密集的标记，紧密连锁的sau(C)586与距离较远的sau(N)033间出现了一定的间隙。BrGSP项目进行至今，大白菜A3和A9连锁群的测序任务已基本完成，本研究将or定位在了几个BAC克隆重叠群之间，并且找到了一个遗传距离较近的标记，陆续公布的克隆序列信息有助于我们可以在以后的研究中针对这一区域进行更加深入的研究，相信通过针对目标基因区域设计新的引物，可以使本文所得到的局部连锁群更加密集。图位克隆技术要求构建目的基因附近的精细遗传图谱(Vrebalov et al., 2002)，在目前的研究基础上，通过构建大规模的分离群体，or基因的精细作图和克隆将有望得以实现。

3材料与方法
3.1试验群体
试验材料为大白菜桔红心F₂代分离群体(Chiifu×07A163)，“Chiifu”为普通白色叶球大白菜自交系，系芸薹属植物基因组测序计划(B.rapa Genome Sequencing program，BrGSP)基础材料，由韩国忠南大学林容杓教授惠赠；“07A163”为桔红色叶球大白菜自交系，由沈阳农业大学蔬菜遗传育种实验室提供(图3)。

图3 白心大白菜自交系“Chiifu”和桔红心自交系“07A163”的表型图(纵向剖面图) 注: A: Chiifu; B: 07A163 Figure 3 Phenotype figures (longitudinal profile) about inbred Lines of Chinese cabbage with the white inner leaf (Chiifu) and orange inner leaf(07A163) Note: A: Chiifu; B: 07A163

2009年8月3日在沈阳农业大学园艺学院试验基地播种两个亲本、120株F₁群体、650株F₂群体，于9月8日定植，用于大白菜桔红心性状遗传分析。在苗期取F₂ 群体单株嫩叶-80 ℃保存，用于桔红心or基因的标记定位研究。在成熟期剖球调查性状。

3.2引物
芸薹属植物基因组测序计划(BrGSP)于2006年发起，由多达7个国家参与研究，且目前已取得阶段性进展。此项研究对于将来大白菜作物一系列相关基因的鉴定、克隆以及应用都具有重要的理论和实际意义。本实验室与韩国忠南大学合作研究，在BrGSP现有研究成果的基础上，根据已得到的大白菜基因组序列信息合成了近500对特异性SSR引物，挑选其中分布于大白菜10条染色体上的430对引物用于本试验双亲间多态性的筛选，所有引物由北京赛百盛公司合成。

3.3桔红心性状遗传分析
配制杂交组合Chiifu×07A163，利用120株F₁代和用于or基因定位的600株F₂代群体进行桔红心基因遗传特性的分析，在植株成熟期剖球，肉眼调查2世代各单株心叶颜色。
 
3.4 DNA提取和基因池的构建
提取方法采用CTAB法(Murray and Thompson, 1980)并略有改动，将提取的DNA调整至50 ng /μ待用。由于无法区分白心单株基因型，所以只选用F₂代桔红心单株构建了3个基因池，利用双亲和构建的3个池进行BSA (bulked segregant analysis)分析(Michelmore et al., 1991)。

3.5 PCR扩增程序与产物检测
PCR反应在BIO-RAD上进行，采用10 μL反应体系：25 ng模板DNA，0.8 μL 2.5 mmol/L dNTP，1.2 μL 10×Buffer (含Mg²⁺)，1 μL 0.5 μmol/L primer，1 U Taq polymerase。PCR反应程序为：95℃预变性5min、95℃变性30 s、57℃退火30 s、72℃延伸30 s、循环30次后，72℃保温5 min。扩增产物置4℃冰箱贮藏备用，6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，聚丙烯酰胺凝胶电泳在北京六一DYCZ220C型电泳槽上进行，预电泳30 min后上样4 μL，60 W恒功率电泳1 h，银染显色。

3.6 连锁分析与or基因定位
根据分离条带基因型，用Mapmaker/Exp3.0软件(Lander et al., 1987)对or基因的遗传连锁关系进行分析(LOD=3.0)并将其定位于相应的染色体上，经Kosambi函数(Kosambi, 1944)换算成遗传距离。

作者贡献
冯辉和李跃飞是本研究的实验设计和实验研究的执行人；李跃飞完成数据分析，论文初稿的写作；冯辉和刘志勇及刘静参与实验设计，试验结果分析；冯辉是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家863计划项目(2006AA10Z170)和教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（20092103110001）共同资助。本文中提到了我们实验中涉及的有关试剂供应商和测序服务商，这并非我们为这些试剂供应商和测序服务商的产品和服务提供推荐或背书。

参考文献
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