出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，是半知菌门、丝孢菌纲、丛梗孢目、暗丛梗孢科、短梗霉属的一种，其发育过程中有酵母状、菌丝体状、厚垣孢子、芽生孢子等多种细胞形态(付湘晋等, 2005; Ronen et al., 2002)。出芽短梗霉能以淀粉水解物、蔗糖和葡萄糖等糖类发酵生产胞外多聚糖——普鲁兰多糖，它具有极佳的成膜性、成纤维性、阻氧性、可塑性、粘结性和易自然降解等许多独特的理化和生物学特性，无毒无害，对人体无任何副作用，可广泛地应用于农业(朱桂兰等, 2012; 卢星达, 2012)、食品工业(相茂功等, 2008; 周美丽, 2015)、制药工业(刘国军, 2014)和化妆品工业中。除此之外，经过化学改良的各种普鲁兰衍生物还是很重要的抗病毒、抗血栓、抗血凝固、抗肿瘤药物的工业原料(Suginoshita et al., 2002; Singh et al., 2015;张超等, 2014)。但由于现有工业化生产菌株产量低、提取成本高，价格昂贵使得实际应用受到了很大的限制。目前报道的研究多集中在普鲁兰多糖的发酵生产(包括发酵条件的研究和突变株的筛选)和生产应用上(Singh et al., 2008; Rajeeva et al., 2010)，有关分子结构、产糖机理、分子修饰以及该多糖生产菌株分子遗传背景的研究较少(Cheng et al., 2011)。另外出芽短梗霉的合成途径尚不是完全清楚，而关于出芽短梗霉合成普鲁兰多糖转录组数据也鲜有报道(Kang et al., 2010; 盛龙, 2015)。

近些年来，有关基因组、转录组、蛋白质组、代谢组和代谢通量组等各种组学技术的研究越来越多，也越来越成熟，它们在揭示细胞生理活动规律和生物代谢机理的研究中也起着更加重要的作用(方翔等,2015; 王松等, 2015)，其中转录组学是率先发展起来以及应用最广泛的技术(Lockhart et al., 2000)。细胞功能是从基因表达开始的，转录组则是某一特定时间和条件下细胞内所有基因转录的RNA总称；通过转录组分析，能够高通量的获得基因表达的RNA信息，并揭示基因表达与某些生命现象之间的内在联系(史硕博, 2010)。转录组测序也可用于研究基因结构与功能、预测可变剪接和新转录本等，与传统的芯片杂交平台技术相比，具有更广泛的检测范围。对于缺乏基因组信息的物种而言，转录组研究也得到了更广泛的应用(贾新平等, 2014a; 周国艳等, 2013)。

为了获得出芽短梗霉合成普鲁兰多糖的转录组信息，本研究采用Illumina HiSeq 2500平台进行高通量测序，结合生物信息学方法开展基因表达谱研究和功能基因预测，以期能够更多的了解普鲁兰的合成途径及代谢调控机理。

1结果与分析

1.1出芽短梗霉转录组数据组装

应用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术，对出芽短梗霉swp35菌体的转录组进行了测序，共获得15525942 reads片段，包含了4.54Gb的序列信息，GC%含量平均值是51.57%，将获得的reads片段进行聚类组装得到7 173 509个Contig序列。其中长度为200~300 bp的Contig序列有7 160 014个，占总体的99.81%。对Contig片段组装后共获得29 919个Transcript， 序列信息达到39 402 845 bp(39.4Mb)，平均长度为1317 bp，N50为2 227 bp。其中长度在200~500 bp的Transcript有11 448个，占总体的38.26%；500~1000 bp 的Transcript 有4 563个，占总体的15.65%；≥1000 bp 的Transcript 有13 908个，占总体的46.48%。对Transcripts序列进行进一步组装，共获得20 312个Unigene，序列信息达到21 109 737 bp，平均长度为1 039.27，N50为1 961 bp。 200~500 bp 的Unigene有10 175个，占总体的50.09%；500~1 000 bp 的Unigene 有2 849个，占总体的14.03%；≥1 000 bp 的Unigene 有7 288个，占总体的35.88% (表1)。

1.2 Unigene 的功能注释

1.2.1 Unigene的序列比对及功能注释

使用BLAST软件将Unigene序列与NR、SwissPort、COG、GO等数据库进行比对，预测Unigene的氨基酸序列，然后使用HMMER软件与Pfam数据库比对，获得Unigene的注释信息。结果表明，在Nr数据库中找到的Unigene相似序列最多，为13445个，在其他数据库中找到Unigene的相似序列相对较少。本项目通过选择BLAST参数E-value不大于10^-5和HMMER参数E-value不大于10^-10，最终获得13465个有注释信息的Unigene，占比66.3%，还有很大比例的未知序列，基因注释的统计结果如下(表2)。

1.2.2 unigene的GO分类

GO 是一个采用动态更新的标准词汇表来描述基因和其产物功能的数据库，目前被广泛应用于生物的转录组数据分析研究中，GO 总共分为3 大功能类，分别为基因的分子功能(molecular function)、所处的细胞位置(cellular component)和所参与的生物过程(biological process) (曾地刚等,2013)。应用GO数据库对出芽短梗霉的Unigene进行功能分类，初步了解出芽短梗霉表达基因的功能分布特征。研究结果表明，出芽短梗霉的Unigene可划分为49个功能组，其中细胞组分16个、分子功能15个、代谢进程18个(表3)。其中代谢进程(3614个)、催化活性(3061个)、细胞进程(2613个)、单一有机体进程(2188个)和结合活性(2177个)功能组中涉及的unigene较多，而细胞外基质(2个)、蛋白标记(1个)和营养库活性类(1个)功能组中涉及的unigene很少。

1.2.3 COG功能分类

COG (clusters of orthologous groups)是对基因产物进行同源分类的数据库，是一个较早的识别直系同源基因的数据库，通过对多种生物的蛋白质序列大量比较而来的。将所测出芽短梗霉Unigene与COG数据库进行比对，结果显示，出芽短梗霉Unigene可分为25类，并对每类的Unigene进行了统计分析(图1)。出芽短梗霉Unigene所涉及的COG功能较为全面涵盖了大部分的生命活动。其中最多的是一般功能预测类基因(R)；然后依次是氨基酸运输和代谢类基因(E)、碳水化合物运输和代谢类基因(G)、矿脂运输和代谢类基因(P)、复制，重组和修复类基因(L)较多；而胞外结构类基因(W)和核结构类基因(Y)数量最少；其他种类的基因表达量都各有不同。

1.2.4 KEGG代谢通路分析

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系统分析基因产物在细胞中的代谢途径以及该基因产物功能的数据库，利用该数据库有助于把基因及表达信息作为一个整体的网络进行研究。将本实验获得的数据以KEGG pathway数据库作为参考，最终获得13465个有注释信息的Unigene。并将检测到的unigene定位到105个具体的代谢途径分支，每个代谢通路所涉及到的基因数量如下(表4)所示。

1.2.5 普鲁兰多糖合成途径关键基因的鉴定

根据目前已有的文献报道，参与普鲁兰多糖合成的关键酶有葡萄糖-6磷酸变位酶，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶，葡糖基转移酶。通过转录组测序，并结合生物信息学分析获得了三个酶系的基因序列(表5)，首次从分子生物学水平证实并完善了普鲁兰多糖生物合成途径。

1.2.6 SSR分析

MISA(MIcroSAtellite identification tool)是鉴定简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)的软件，它可以通过对Unigene序列的分析，鉴定出6种类型的SSR。 利用MISA软件对筛选得到的7288条1kb以上的Unigene做SSR分析，共检测到670个SSR位点(表6)。其中单核苷酸重复为369个，达到55.07%，其次是三核苷酸重复为226个，占比33.73%，在筛选过程中，为确保SSR 位点的潜在多态性，我们将四、五和六核苷酸的最小重复次数均设定为5，一定程度上影响了这几类核苷酸重复在总SSR 位点中的比例。SSR的特征分析，有助于开展出芽短梗霉基因组差异分析、通用性标记开发和遗传图谱构建等研究。

2讨论

随着二代高通量测序技术的成熟和广泛应用，不仅完全改变了过去的研究模式，给人类和动植物基因组学、转录组学、宏基因组组学研究方面带来了全新的变化，并且逐步深入到微生物学的研究领域中(秦楠等，2011)。但是目前关于出芽短梗霉基因组的研究还相对较少，转录组研究还处于空白状态。Illumina高通量测序的特点是数据量大、速度快、成本低、效率高，适合于没有基因组信息的样本开展转录组测序研究(祁云霞等, 2011)。基于转录组学在功能基因研究中的重要地位，本研究通过Illumina高通量测序技术对出芽短梗霉转录组进行测序，研究其基因表达谱，挖掘不同代谢产物中的差异表达基因。通过对出芽短梗霉转录组测序共获得15525942个reads序列；对reads序列拼接后获得了7 173 509个Contig序列。将Contig序列进行组装得到了20 312个Unigene，它们的平均长度为1 039.27，N50为1 961 bp。N50值越大，反映组装得到的长片段越多，组装效果就越好。测序数据产量和数据组装质量是转录组测序完成情况的重要指标(贾新平等, 2014b)。上述结果表明，此次序列组装的质量和长度均可满足转录组分析要求，进一步说明Illumina HiSeq 2500是转录组测序的可靠平台。

将出芽短梗霉Unigene与Nr、SwissPort等数据库进行序列比对，出芽短梗霉的20312条Unigene中有13465条Unigene与数据库中的其他已知基因具有不同程度的同源性，另外还获得了6867条Unigene与数据库中的已知基因同源性较低，占总体的33.81%，有可能是未知基因。

COG 和GO 的功能分类对初步了解基因的功能起着重要作用，而KEGG 数据库中的参考pathway不仅可以推测基因的功能，而且可以研究基因在不同代谢通路中所在位置及作用，三者相辅相成，成为新物种中发掘功能基因的重要手段 (贾新平等,2014a; Wang et al., 2013)，基于KEGG 通路的分析有助于我们进一步了解基因的生物学功能 (Kanehisa et al., 2000)。通过这些注释，我们能够了解基因的分子功能、所处细胞位置、所参与的生物过程、所处代谢途径或信号通路等等(曾地刚等,2013)，同时我们也找到了普鲁兰多糖合成过程中的3个关键酶的基因序列，这为今后进一步挖掘出芽短梗霉发酵生产普鲁兰多糖过程中的重要表达调控基因，开展通过基因或代谢途径调整控制普鲁兰多糖合成的产量及分子量等方面的研究提供了基础数据。

SSR分子标记具有重复性好、好时短、成本低、遗传信息量大、共显性遗传等优点，因此在基因定位、基因克隆、功能基因发掘、遗传图谱构建、分子标记辅助育种等研究中得到了广泛应用 (Yang et al., 2009; 刘峰等, 2012)。目前，出芽短梗霉可用的SSR数量非常有限，转录组数据为开发SSR分子标记提供了丰富和极有价值的可利用资源。本研究通过查找发现了个670个SSR位点，SSR出现频率高且类型丰富。SSR分子标记的开发有助于出芽短梗霉功能基因的挖掘和遗传多样性分析的研究，并有助于促进真菌类分子生物学的发展。

3材料与方法

3.1实验材料

出芽短梗霉Aureobasiudium pullulans swp35， 由本课题组选育获得，20%甘油管中保藏，存于-80℃低温冰箱。采用PDA(Potato D-glucose Agar)培养基活化，28℃，培养5d。液体培养基(g/L)： 蔗糖 50，MgSO₄•7H₂O 0.2，K₂HPO₄ 5.0，(NH₄)₂SO₄ 0.6，酵母粉 1.7，NaCl 1.0， pH 6.5。通过液体培养基扩大培养，72h后通过离心收集菌体，使用50mM Tris-HCl (pH 7.8) 洗涤菌体两次，菌体储存到-80℃备用。

3.2实验方法

3.2.1 RNA提取

使用Takara RNA Plus*试剂盒提取出芽短梗霉菌体的总RNA。将菌体放入研钵，加入适量液氮速冻研磨，将菌体干粉转移到DEPC处理的1.5 mL离心管中，加入1mL RNAiso Plus振荡混匀，静置5min；12000 rpm、 4℃离心5 min，将上清转移至新的1.5 mL离心管，加入200uL的氯仿振荡混匀，室温静置5 min；12000rpm、 4℃离心15 min，将上清液移至新的离心管，加入1mL的异丙醇，室温静置10 min； 12000 rpm、4 ℃离心10 min，除上清，用1mL RNase-free水配制的75%乙醇清洗沉淀； 10000 rpm、4℃离心5min，弃上清保留沉淀；自然干燥，溶解于适量的DEPC处理水中，保存于-70℃备用。用AgiLent 2100 BioanaLyzer检测RNA提取质量，RIN值≥7.0。

3.2.2 RNA文库构建及数据组装

(1)用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA；

  (2)加入Fragmentation Buffer将mRNA随机打断；  

(3)以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，利用AMPure XP beads纯化cDNA；

(4) 纯化后的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择；

(5)最后通过PCR富集得到cDNA文库。

(6) 文库构建完成后，分别使用Qubit2.0和Agilent 2100对文库的浓度和插入片段大小(Insert Size)进行检测，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。

(7)库检合格后，用HiSeq2500进行高通量测序，测序读长为PE125。

(8)对Raw Data进行数据过滤，去除其中的接头序列及低质量Reads获得高质量的Clean Data。 将Clean Data进行序列组装，获得该物种的Unigene库。

3.2.3功能注释、分类和代谢途径分析

使用BLAST软件将Unigene序列与NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG数据库比对(BLAST参数E-value不大于10^-5)，预测完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER软件与Pfam数据库比对(HMMER参数E-value不大于10^-10)，获得Unigene的注释信息、分类及KEGG代谢网络分析。

3.2.4 SSR位点搜索及分析

对出芽短梗霉转录组中的Unigene序列进行SSR位点搜索，标准为：单、二、三、四、五、六核苷酸基序最少重复次数分别为10、8、5、5、5、5，并对查找到的SSR类型进行特征分析。

作者贡献

马赛箭、安超负责数据分析、论文撰写和部分实验工作，上官亦卿负责出芽短梗霉的发酵及样品处理，薛文娇负责总体设计和研究指导。

致谢

本研究由西部之光(2013DF01)，陕西省自然科学基金(2014JM2-2015)和陕西省科学院科技计划项目(No. 2013K-06)和科技计划重点项目(No. 2014K-01)共同资助。

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